原代細(xì)胞是直接取自活組織
例如活組織檢查材料
的細(xì)胞，并建立用于體外生長(zhǎng)钦听。這些細(xì)胞經(jīng)歷了非常少的群體倍增洒试，因此與連續(xù)
腫瘤或人工永生化
細(xì)胞系相比，它們更能代表它們所衍生組織的主要功能成分朴上，使得原代細(xì)胞成為更具代表性的體內(nèi)模型垒棋。
原代細(xì)胞分離是指將組織分散制成細(xì)胞懸液后從中獲取目的細(xì)胞的過(guò)程，獲得高純度痪宰、高活性的原代細(xì)胞則是很多細(xì)胞實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵要素之一叼架，原代細(xì)胞分離的方法有很多種：懸浮離心法、直接組織塊法衣撬、酶消化法乖订、非酶消化法、機(jī)械分散法等淮韭。
人或動(dòng)物體內(nèi)
或胚胎組織
由于多種細(xì)胞結(jié)合緊密垢粮，不利于各個(gè)細(xì)胞在體外培養(yǎng)中生長(zhǎng)繁殖，即使采用1mm3 的組織塊靠粪，也只有少量處于周邊的細(xì)胞可能生存和生長(zhǎng)蜡吧，若需獲取大量細(xì)胞，必須將現(xiàn)有的組織塊充分散開(kāi)占键，使細(xì)胞解離出來(lái)昔善，常采用的方法如下：
一、懸浮細(xì)胞的分離方法
組織材料若來(lái)自血液畔乙、 羊水君仆、胸水或腹水的懸液材料， 最簡(jiǎn)單的方法是采用 1000r/min 的低速離心 10 分鐘牲距，若懸液量大返咱，可適當(dāng)延長(zhǎng)離心時(shí)間，但速度不能太高牍鞠，延時(shí)也不能太長(zhǎng)咖摹，以避免擠壓或機(jī)械損傷細(xì)胞，離心沉淀用無(wú)鈣难述、鎂 PBS 洗兩次萤晴，用培養(yǎng)基洗一次后吐句，調(diào)整適當(dāng)細(xì)胞濃度后再分瓶培養(yǎng)，若選用懸液中某些細(xì)胞店读，常采用離心后的細(xì)胞分層液嗦枢，因?yàn)椋?jīng)離心后由于各種細(xì)胞的比重不同可在分層液中形成不同層屯断，這樣可根據(jù)需要收獲目的細(xì)胞文虏。
二、實(shí)體組織材料的分離方法
對(duì)于實(shí)體組織材料裹纳，由于細(xì)胞間結(jié)合緊密择葡，為了使組織中的細(xì)胞充分分散紧武，形成細(xì)胞懸液剃氧，可采用機(jī)械分散法
物理裂解
和消化分離法。
一
機(jī)械分散法
所取材料若纖維成分很少阻星，如腦組織朋鞍，部分胚胎組織可采用剪刀剪切、用吸管吹打分散組織細(xì)胞或?qū)⒁殉浞旨羲榉稚⒌慕M織放在注射器內(nèi)
用九號(hào)針
妥箕，使細(xì)胞通過(guò)針頭壓出滥酥，或在不銹鋼紗網(wǎng)內(nèi)用鈍物壓擠
常用注射器鈍端
使細(xì)胞從網(wǎng)孔中壓擠出。此法分離細(xì)胞雖然簡(jiǎn)便畦幢、快速坎吻，但對(duì)組織機(jī)械損傷大，而且細(xì)胞分散效果差宇葱。此法僅適用于處理纖維成分少的軟組織瘦真。
二
消化分離法
組織消化法是把組織剪切成較小團(tuán)塊
或糊狀
，應(yīng)用酶的生化作用和非酶的化學(xué)作用進(jìn)一步使細(xì)胞間的橋連結(jié)構(gòu)松動(dòng)黍瞧，使團(tuán)塊膨松诸尽，由塊狀變成絮狀，此時(shí)再采用機(jī)械法印颤，用吸管吹打分散或電磁攪拌或在搖珠瓶中振蕩您机，使細(xì)胞團(tuán)塊得以較充分的分散，制成少量細(xì)胞群團(tuán)和大量單個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞懸液年局，接種培養(yǎng)后际看，細(xì)胞容易貼壁生長(zhǎng)。
消化分離法的操作步驟
1
剪切把組織塊剪碎矢否，呈 1~5mm3 大小的組織塊仲闽。
2
加液漂洗 將碎組織塊在平皿
或三角燒瓶
中用無(wú)鈣鎂 PBS 洗 2-3 次
采用傾斜，自然沉降法
兴喂。
3
消化 加入消化液
胰蛋白酶或膠原酶或 EDTA
于 37℃水浴中作用適當(dāng)時(shí)間
中間可輕搖 1~2 次
蔼囊，若組織塊膨松呈絮狀可終止焚志，若變化不大可更換一次消化液，繼續(xù)消化直至膨松絮狀為止畏鼓。胰蛋白酶消化時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)酱酬。
4
棄去消化液 采用傾斜自然沉降或低速離心法盡量棄去消化液。
5
漂洗 將含有鈣云矫、鎂離子的培養(yǎng)基沿瓶壁緩緩加入膳沽，中止消化反應(yīng)，采用漂洗法洗 2-3 次后让禀，加入完全培養(yǎng)基挑社。
6
機(jī)械分散 采用吸管吹打或振蕩法，使細(xì)胞充分散開(kāi)后用紗網(wǎng)或 3~4 層無(wú)菌紗布過(guò)濾后分瓶培養(yǎng)巡揍，若要求不高可采用傾斜自然沉降 5~10 分鐘痛阻，吸上層細(xì)胞懸液進(jìn)行分瓶培養(yǎng)。
注意事項(xiàng)如下
1
組織塊必須漂洗 2-3 次以除去組織中的鈣腮敌、鎂離子和血清對(duì)胰蛋白酶和 EDTA 的抑制作用阱当。
2
胰蛋白濃度不宜過(guò)高，作用時(shí)間不能太長(zhǎng)糜工，以避免毒性作用弊添。
3
消化后組織不僅要盡量棄去消化液，以避免毒性產(chǎn)生捌木，而且動(dòng)作要輕油坝，以避免膨松的細(xì)胞隨漂洗而丟失
三、酶消化法
1）無(wú)菌
確保使用無(wú)菌設(shè)備刨裆、試劑和技術(shù)收集和處理組織澈圈。使用個(gè)人防護(hù)設(shè)備以避免污染。使用0.22微米的膜無(wú)菌過(guò)濾所有酶和試劑崔拥。
2）切塊
用無(wú)菌剪刀或手術(shù)刀將組織標(biāo)本切成小塊
通常為2×4mm
极舔，然后將小塊放入選定的緩沖液、培養(yǎng)基或鹽溶液中链瓦。
3）加酶
將組織清洗三次以消除多余的血液蛋白拆魏，然后加入您選擇的酶如膠原酶、蛋白酶慈俯、木瓜蛋白酶或胰蛋白酶渤刃。通常，約0.5 mg/ml～1.5mg/ml的酶贴膘。
4）孵育
將組織樣本在其最佳溫度下孵育卖子，通常在37℃下孵育30～90分鐘。定期混合或輕輕搖動(dòng)標(biāo)本刑峡。
5）洗滌
通過(guò)輕輕移液來(lái)分散細(xì)胞
也稱為研磨
洋闽，然后玄柠，使用細(xì)網(wǎng)過(guò)濾細(xì)胞懸浮液。讓細(xì)胞沉淀并潷出多余的含液酶;洗兩到三次诫舅。含有FBS羽利，BSA或其他抑制劑的洗滌溶液也可用于阻止酶消化。
6）分析
將細(xì)胞重懸于正確的培養(yǎng)基或緩沖液中刊懈，然后定量測(cè)定細(xì)胞產(chǎn)量和活力这弧。這是細(xì)胞分離過(guò)程中的重要步驟，因此您可以評(píng)估解離技術(shù)的結(jié)果虚汛。大多數(shù)研究人員使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器測(cè)定細(xì)胞產(chǎn)量匾浪，并使用臺(tái)盼藍(lán)重氮染料測(cè)量細(xì)胞活力。
