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空間轉(zhuǎn)錄組主要是針對(duì)在組織中的mRNA轉(zhuǎn)錄譜的研究≡鹑拢現(xiàn)在被廣泛應(yīng)用的觀察單細(xì)胞定位的儀器有顯微鏡÷睿現(xiàn)在進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序的方法有很多昔字，比如droplets亭螟。然后你把你的細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，之后測(cè)序。
但是組織并不是均一的捎废，上圖展示了幾個(gè)不同的組織，將不同類型的細(xì)胞進(jìn)行染色后你發(fā)現(xiàn)組織里包含了各種各樣的細(xì)胞。即使在腫瘤組織里瓤檐，也有很多的空間結(jié)構(gòu)赂韵。這種空間結(jié)構(gòu)會(huì)給我們提供很多有用的生物信息。
現(xiàn)在我們有一些方法可以直接檢測(cè)到原位組織中的RNA挠蛉。根據(jù)目前現(xiàn)有的方法可以把它們分成如下4類：
這一講主講人將主要介紹前三種方法祭示。因?yàn)榍叭N都是基于顯微鏡技術(shù)的。
那怎么檢測(cè)組織里的RNA呢谴古？最常用的方法是原位雜交质涛。上圖的示意圖里，灰色的線條是RNA掰担，然后根據(jù)靶標(biāo)RNA設(shè)計(jì)分子探針（黑色線條）汇陆，這個(gè)分子探針是被標(biāo)記的，使得你的靶標(biāo)RNA可以可視化带饱。FISH就是一種基于熒光顯色的技術(shù)的原位雜交毡代。
上圖是RNA scope的方法。這種方法也是針對(duì)你的靶向RNA設(shè)計(jì)探針勺疼。你可以同時(shí)檢測(cè)2個(gè)以上的RNA靶標(biāo)教寂。這種探針是“z”字型的，“z”字型的底部結(jié)合RNA执庐，而“z”字型的頂部也包含28個(gè)堿基酪耕，這些堿基是用來(lái)放大信號(hào)的。這樣一來(lái)被結(jié)合的RNA的信號(hào)被放大轨淌，更易于觀察迂烁。
上圖是一個(gè)例子，左邊是整體圖猿诸，右邊是放大的圖婚被。這里是同時(shí)檢測(cè)了三個(gè)RNA（白色、紅色梳虽、綠色）址芯，從圖里的點(diǎn)的密度可以量化這三種RNA里，白色對(duì)應(yīng)的RNA的量是最高的窜觉，因?yàn)榘咨c(diǎn)的密度是最大的谷炸。
隨著技術(shù)的發(fā)展，又出現(xiàn)了單細(xì)胞的FISH禀挫。這是一個(gè)非擴(kuò)增的技術(shù)旬陡。這種方法可以對(duì)單個(gè)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄本定量，并且提供空間信息语婴。上圖中的每一個(gè)點(diǎn)就是一個(gè)單個(gè)RNA分子描孟。上圖有邊的是單個(gè)細(xì)胞驶睦，這樣就可以看到單細(xì)胞里的RNA的豐度和空間分布了。比如上圖左邊里有兩個(gè)細(xì)胞含有非常多的紅色標(biāo)記的基因匿醒，假如紅色標(biāo)記基因是你感興趣的场航，那么你就可以初步判斷這個(gè)基因是不是主要表達(dá)在特定細(xì)胞里的。這種方法的靈敏度非常高廉羔，假陽(yáng)性和假陰性的比例也很小溉痢。因?yàn)槊恳环N靶標(biāo)RNA的探針數(shù)量很多，是過(guò)量的憋他，如果其中一些不太好孩饼，還有其他的可以作為補(bǔ)充。
然而基于顯微鏡的檢測(cè)技術(shù)是有一定的局限性的竹挡，因?yàn)楹芏囡@微鏡能同時(shí)檢測(cè)的熒光數(shù)量并不多镀娶。比如你有一臺(tái)不錯(cuò)的顯微鏡，但是最多只能同時(shí)測(cè)8種熒光此迅。而你想檢測(cè)的基因遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于8種的時(shí)候汽畴，這種方法就不太合適了。
為了克服上述的技術(shù)難題耸序，有些人發(fā)明出了上圖這個(gè)循環(huán)染色的方法忍些。很簡(jiǎn)單：第一輪染色你可以染幾種熒光，然后拍照坎怪。之后把熒光洗掉罢坝，再染其他探針標(biāo)記的RNA，進(jìn)行第二輪染色搅窿。再拍照嘁酿。最后把兩輪染色的圖merge一下。如果你的顯微鏡特別的差男应，這種方法倒是可以試一試闹司。
基于上面循環(huán)染色的技術(shù)是osmFISH（環(huán)狀單分子熒光原位雜交技術(shù)）。來(lái)看一張染色圖：
這張圖沐飘，每一輪染色染3個(gè)基因游桩，然后把所有的圖merge在一起的結(jié)果。那么如何分析這圖呢耐朴？下面是一個(gè)示意圖：
首先你對(duì)你的組織進(jìn)行染色借卧，然后你要把你的組織里的細(xì)胞進(jìn)行segmentation（分隔），這樣有利于你后面的統(tǒng)計(jì)筛峭。然后把每一個(gè)細(xì)胞畫出邊界铐刘。最后你會(huì)得到一個(gè)表，每一個(gè)細(xì)胞里的每一個(gè)基因?qū)?yīng)的RNA分子的豐度影晓。很顯然镰吵，這些步驟里面最重要的一步就是細(xì)胞的分隔（segmentation）,同時(shí)這一步也是最難的檩禾。
怎么進(jìn)行cell segmentation呢？舉個(gè)例子：上圖里DNA用hoechst進(jìn)行染色捡遍，藍(lán)色锌订。再標(biāo)記出組織里所有的mRNA。眾所周知画株，mRNA有polyA尾巴。所以你只需要設(shè)計(jì)針對(duì)polyA尾巴的探針就可以標(biāo)記出所有的mRNA啦辐。絕大部分的mRNA是在cell body里谓传，所以你可以分清楚兩個(gè)細(xì)胞的邊界在那里。（這里注意芹关，如果是腦組織可能會(huì)不一樣续挟，細(xì)胞和細(xì)胞之間沒(méi)有這么緊湊）
還有一種方法，如果你的組織樣品里的細(xì)胞是一個(gè)緊挨一個(gè)的侥衬，像上圖一樣诗祸。你可以對(duì)細(xì)胞膜進(jìn)行染色。
在你進(jìn)行細(xì)胞分隔以后轴总，你就可以對(duì)每一個(gè)細(xì)胞里的你檢測(cè)的RNA豐度進(jìn)行定量了直颅。上圖顯示，你會(huì)得到一個(gè)表怀樟，這個(gè)表長(zhǎng)得和scRNA-seq的表差不多功偿。之后你可以做的事情和單細(xì)胞測(cè)序一樣，比如聚類往堡，下圖的熱圖就是標(biāo)記的33個(gè)基因在不同細(xì)胞群里表達(dá)的情況：
再比如說(shuō)械荷，tSNE降維：
最后在回到最開(kāi)始的完整圖，這樣你就知道每一個(gè)細(xì)胞群大概來(lái)自組織的哪個(gè)部位：
這種Cyclic smFISH技術(shù)的分辨率大概是150~300納米之間虑灰。檢測(cè)效率是100%６窒埂！穆咐！每一輪染色后洗掉熒光颤诀，再染第二輪，會(huì)損失掉大概2%-5%的dots庸娱，不過(guò)這種損失可以忽略不計(jì)的着绊。但是這種方法會(huì)非常費(fèi)時(shí)，如果你要染14輪熟尉，你大概要需要50天的時(shí)間來(lái)進(jìn)行归露。而且如果你要檢測(cè)的RNA豐度很低，熒光亮度會(huì)很低斤儿。請(qǐng)注意：普通的confocal是不適合這種方法的剧包！你需要更精密的儀器恐锦。
接下來(lái)主講人講了第二種方法進(jìn)行空間轉(zhuǎn)錄組的研究：barcode FISH。這種方法也是將組織染幾次疆液，但是這幾次染的靶向RNA是一樣的一铅，比如上圖，第一輪染了9種RNA堕油，而第二輪染的還是這9個(gè)靶標(biāo)潘飘。區(qū)別是兩輪用的barcode的顏色是不一樣的，但有可能一樣掉缺。這樣把兩次染的圖片merge在一起卜录，根據(jù)兩個(gè)barcode的顏色組合，就可以分辨出哪個(gè)RNA在組織中的哪個(gè)部分了眶明。這個(gè)方法有什么優(yōu)點(diǎn)呢艰毒？
這種方法的好處是：你可以在幾輪染色后染成千上萬(wàn)個(gè)基因。它根據(jù)不同的barcode的排列組合來(lái)決定的搜囱。像上圖丑瞧。這種方法的分辨率也是150300nm之間，但是效率只有70%90%之間蜀肘。
接下來(lái)就是第三種方法：原位測(cè)序绊汹。這種方法與前兩種不同的地方是它是基于測(cè)序方法的，盡管分子還在組織中幌缝，仍然可以進(jìn)行測(cè)序灸促，而不是把它們放進(jìn)illumine的機(jī)器進(jìn)行測(cè)序。這種方法使用一種“掛鎖”狀的探針（上圖）涵卵，然后你把這個(gè)“鎖狀”的環(huán)擴(kuò)增浴栽，擴(kuò)增很多很多的copies。
然后你用你的測(cè)序探針?lè)湃脒M(jìn)去轿偎，4種堿基分別有4種顏色典鸡，比如A是紅色，那么如果你檢測(cè)到了紅色坏晦，說(shuō)明這個(gè)barcode的第一個(gè)堿基是A萝玷。然后你將它洗脫掉，然后再檢測(cè)第二個(gè)堿基昆婿。這樣的檢測(cè)進(jìn)行幾輪后球碉，你就知道你的barcode是什么了。
（這一段講的確實(shí)太亂仓蛆，還是看一下發(fā)明這個(gè)技術(shù)的實(shí)驗(yàn)室做的視頻吧睁冬，下面我截了幾個(gè)屏，感受一下看疙。視頻地址：https://wyss.harvard.edu/technology/fluorescent-in-situ-sequencing-fisseq/）：
