題目：Single-Cell RNA-Seq of T Cells in B-ALL Patients Reveals an Exhausted Subset with Remarkable Heterogeneity
發(fā)表期刊：Advanced Science(IF:16.806)
發(fā)表年份：2021-08-08
摘要
背景：功能性T細(xì)胞亞群特征是制定免疫治療策略和預(yù)測(cè)白血病臨床反應(yīng)的關(guān)鍵古劲。
方法：從健康個(gè)體和急性B淋巴細(xì)胞白血病 (B-ALL) 患者的外周血中分選出 T 細(xì)胞趁俊，進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序栈雳。根據(jù)基因表達(dá)篱蝇，無監(jiān)督聚類將細(xì)胞分為13 個(gè) T 細(xì)胞亞群匿沛。在 B-ALL 患者中發(fā)現(xiàn)了健康個(gè)體的所有 11 個(gè)主要 T 細(xì)胞亞群羡鸥，B-ALL中T細(xì)胞顯示出更多的免疫通路活化特征州邢。B-ALL中有2個(gè)耗竭性T細(xì)胞群，其特征是 TIGIT司致、PDCD1、HLADRA聋迎、LAG3 和 CTLA4高表達(dá)脂矫。值得注意的是，這些耗竭性T細(xì)胞群具有顯著的異質(zhì)性霉晕，將其并進(jìn)一步分為 10 個(gè)亞群庭再，具有不同的細(xì)胞周期階段、navie狀態(tài)和 GNLY（編碼顆粒溶素）表達(dá)模式特征牺堰。結(jié)合TCR分析拄轻，揭示B-ALL 中耗竭性 T 細(xì)胞的不同來源，克隆擴(kuò)增的耗竭性T細(xì)胞可能來自CD8+ 效應(yīng)記憶/終端效應(yīng)細(xì)胞（CD8+ effector memory/terminal effector cells）伟葫。
實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及質(zhì)控
樣本：3個(gè)B-ALL患者和2名健康對(duì)照樣本的外周血單核細(xì)胞(Peripheral blood mononuclear cells ,PBMCs)
細(xì)胞前處理： 流式分選恨搓，其中使用到的流式抗體包括CD45，CD3扒俯，CD4和CD8奶卓。
細(xì)胞過濾標(biāo)準(zhǔn)： more than 800 genes and 2000 UMIs and less than 15% of reads mapped to mitochondrial genes were retained.因?yàn)樽髡咧饕P(guān)注免疫細(xì)胞，接著 用CD3D, CD3E, CD3G, CD247 genes 這4個(gè)基因的平均表達(dá)量作為CD3的平均表達(dá)量撼玄，如果CD3平均表達(dá)值>0.5,則納入下游分析夺姑。此外只保留在至少10個(gè)細(xì)胞以上有表達(dá)值得細(xì)胞。最后掌猛，總共剩下28842(健康對(duì)照樣本喲12 699個(gè)細(xì)胞盏浙，B-ALL患者有16143個(gè)細(xì)胞）進(jìn)入下游分析。
結(jié)果
1.在 B-ALL 患者中特別發(fā)現(xiàn)了兩群耗竭性T細(xì)胞亞群
首先荔茬，無監(jiān)督聚類分析發(fā)現(xiàn)废膘，健康個(gè)體的T細(xì)胞可以分為11 群，而B-ALL患者的T細(xì)胞可以分為13 群（Fig 1B）慕蔚。
2. 不同的 T 細(xì)胞亞型在 B-ALL 中普遍表現(xiàn)有更多的激活特征
接下來穷当，接著他們將健康個(gè)體和 B-ALL 患者的所有 T 細(xì)胞結(jié)合起來分析。健康個(gè)體中中 11 個(gè) T 細(xì)胞亞群與 B-ALL 患者中的相應(yīng)的亞群聚合在一起展示（Fig 2A）淹禾。成對(duì) Pearson 相關(guān)分析還表明馁菜，兩組患者的 T 細(xì)胞簇具有相似的表達(dá)模式（除了CD4_Exhau 和 CD8_Exhau，F(xiàn)ig 2B）铃岔。
3. B-ALL 中耗竭 性T 細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組學(xué)異質(zhì)性
接著他們重點(diǎn)放在耗竭性T細(xì)胞亞群上坠陈。首先 CD4/CD8耗竭性T細(xì)胞亞群可進(jìn)一步細(xì)分為10個(gè)亞群（Fig 3A）萨惑。這10個(gè)亞群顯示表達(dá)不同水平的耗竭性marker，并且與細(xì)胞周期狀態(tài)仇矾、naive狀態(tài)或 GNLY 表達(dá)相關(guān)等表達(dá)模式組合時(shí)庸蔼，每個(gè)亞群似乎并不重疊或者說互相靠近。Ex_CD4 和 Ex_CD4_GNLY+贮匕、Ex_CD8 和 Ex_CD8_GNLY+姐仅、Ex_CD4_cc 和 Ex_CD4_cc_GNLY+，以及 Ex_CD8_cc 和 Ex_CD8_cc_GNLY+ 可根據(jù)GNLY 表達(dá)水平區(qū)分開來（Fig 3C）刻盐。
Ex_CD4 和 Ex_CD4_GNLY+掏膏、Ex_CD8 和 Ex_CD8_GNLY+、Ex_CD4_cc 和 Ex_CD4_cc_GNLY+敦锌，以及 Ex_CD8_cc 和 Ex_CD8_cc_GNLY+ 被 GNLY 表達(dá)水平區(qū)分開來（Fig 3C）馒疹。此外，GSEA比較了四個(gè)耗竭性的 GNLY+ 亞群（Ex_CD4_GNLY+供屉、Ex_CD8_GNLY+行冰、Ex_CD4_cc_GNLY+ 和 Ex_CD8_cc_GNLY+）通路富集變化。結(jié)果表明伶丐， GNLY +的亞群在 TCR 信號(hào)通路悼做、自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性和細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用中被激活（Fig S4D）（備注：原圖不清晰，所以沒放上來）哗魂。因此肛走，他們得出結(jié)論，T細(xì)胞的GNLY 的表達(dá)量與其具有更高的細(xì)胞毒性能力呈正相關(guān)录别⌒嗌總的來說，耗竭性T 細(xì)胞應(yīng)被視為一個(gè)具有異質(zhì)性質(zhì)的“細(xì)胞室”组题，里面由處于不同狀態(tài)的 T 細(xì)胞組成葫男，可能具有不同的生物學(xué)功能。
4.TCR分析表明 B-ALL 患者存在廣泛的 T 細(xì)胞轉(zhuǎn)變
接下來進(jìn)入TCR部分夏伊。為了確定 B-ALL 狀態(tài)下發(fā)生克隆性 T 細(xì)胞擴(kuò)增的程度摇展，他們對(duì) B-ALL 患者的 T 細(xì)胞進(jìn)行了克隆分析（Fig 4A）。（備注：3種顏色對(duì)應(yīng)3個(gè) TCR 克隆擴(kuò)增組溺忧，其中“> = 3”表示至少有三個(gè) T 細(xì)胞表達(dá)相同的 TCR 克隆型咏连，“2”表示有兩個(gè) T 細(xì)胞表達(dá)相同的 TCR 克隆型，“1” ”表示只有一個(gè) T 細(xì)胞表達(dá)的 TCR 克隆型)鲁森。
克隆擴(kuò)增的細(xì)胞主要處于 G0/G1 期冠蒋，并高度表達(dá)細(xì)胞毒性效應(yīng)分子顆粒酶 B 和 H（GZMB 和 GZMH）羽圃、FGFBP2、GNLY抖剿、NKG7朽寞、KLRD1 和趨化因子 (CCL5)（Fig 4B and C）。
富集分析表明斩郎，這些細(xì)胞更多地參與抗原加工和呈遞脑融、淋巴細(xì)胞活化、免疫反應(yīng)和細(xì)胞防御途徑（Fig4 D）缩宜。
Pearson 相關(guān)分析評(píng)估了每個(gè)亞群中克隆組合之間的關(guān)系（Fig4 F）。發(fā)現(xiàn)4個(gè)耗竭性CD4+T細(xì)胞群聚集在一起捂龄，4個(gè)耗竭性CD8+T細(xì)胞群也聚集在一起释涛，表明它們具有相似的TCR特征.
而且CD8_EM 和 CD8_TE 之間也聚集在一起。與其他 T 細(xì)胞亞群相比倦沧，這2群（CD8_EM 和 CD8_TE）與耗竭性 CD8+ 群體共享更多的TCR唇撬。耗竭性群體與 CD8_TE 和 CD8_EM 之間共享的克隆數(shù)分別為 30/2133（1.41%）和 28/2133（1.31%）。而其他 T 細(xì)胞簇也與耗竭性群體共享“有限”的 TCR（Fig 4G）展融。這些數(shù)據(jù)表明局荚，不同的 T 細(xì)胞亞群絕不是完全孤立的，它們可能會(huì)經(jīng)歷廣泛的狀態(tài)轉(zhuǎn)換愈污。他們推測(cè)耗竭性CD8+耀态、CD8_TE和CD8_EM細(xì)胞群體可能具有相同的來源或者說是分化途徑有交聯(lián)。同樣地暂雹，耗竭性CD4+簇和CD4_TE也存在這種情況首装。
總結(jié)
這篇文章的討論部分我展示一點(diǎn)，其他的大家有興趣的話可以去看原文杭跪。作者他們發(fā)現(xiàn)B-ALL中有2群特異性的耗竭性T細(xì)胞亞群（CD8_TE 和CD4_TE ）仙逻，而且耗竭性T細(xì)胞亞群不是離散狀態(tài)驰吓，而是包含了不同的狀態(tài)。有一些耗竭性細(xì)胞群體顯示出細(xì)胞毒性評(píng)分較低的navie特征系奉，而其他細(xì)胞表現(xiàn)有較高的增殖分?jǐn)?shù)檬贰，并且耗竭評(píng)分相對(duì)較低。已知缺亮，naive樣的耗竭性T細(xì)胞在經(jīng)過抗檢查點(diǎn)治療后會(huì)大量增殖翁涤。他們推測(cè)這些細(xì)胞可能只是在耗竭程序積累期間開始出現(xiàn)增殖特征，而隨著時(shí)間的推移會(huì)逐漸失去了它們的增殖特征萌踱。例如在2019年cell的一篇黑色素瘤的文章中(PMID:PMC7253294),可以看到葵礼，CD8 T細(xì)胞實(shí)際上處于高度增殖，克隆和動(dòng)態(tài)分化的階段并鸵，而這種高度增殖能力主要與功能失調(diào)程序的初始啟動(dòng)積累有關(guān)鸳粉，而更advanced的功能失調(diào)性細(xì)胞則失去了這種增殖特征。
總的來說园担，這篇文獻(xiàn)揭示了B-ALL中CD45+CD3+ T細(xì)胞在聚類届谈，免疫活性和異質(zhì)性方面的詳細(xì)特征，描繪的B-ALL中T細(xì)胞的表征將有助于更好地了解基于免疫療法靶向B-ALL有效性的潛在機(jī)制弯汰。
