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染色質(zhì)免疫沉淀后測(cè)序（ChIP-seq）是一種針對(duì)DNA結(jié)合蛋白，組蛋白修飾或核小體的全基因組分析技術(shù)梯找。隨著測(cè)序成本的降低，ChIP-seq已成為研究基因調(diào)控和表觀遺傳機(jī)制不可或缺的工具。在這篇文章中，我們對(duì)前面的內(nèi)容做一個(gè)總結(jié)漠趁，分析下現(xiàn)階段ChIP-seq存在著哪些需要注意的問(wèn)題以及我們?cè)撊绾胃玫乩眠@項(xiàng)技術(shù)獲得研究成果。

（一）ChIP-seq現(xiàn)階段存在的問(wèn)題

1.甲醛交聯(lián)對(duì)后續(xù)結(jié)果分析的影響

甲醛雖然是一種高度滲透的交聯(lián)劑躺屁，但由于其反應(yīng)活性?xún)H限于胺撩穿，因此其交聯(lián)效率較低磷支；對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞而言，其最大交聯(lián)效率僅為1%食寡。在DNA上停留時(shí)間短于5秒的蛋白無(wú)法用蛋白質(zhì)交聯(lián)雾狈。另外，甲醛還會(huì)導(dǎo)致許多其他無(wú)關(guān)蛋白質(zhì)交聯(lián)到DNA上抵皱，影響后續(xù)分析數(shù)據(jù)善榛。有研究稱(chēng)，甲醛交聯(lián)會(huì)觸發(fā)DNA損傷應(yīng)答機(jī)制呻畸，從而改變?nèi)旧|(zhì)組分移盆，進(jìn)而使ChIP結(jié)果產(chǎn)生偏向性。由于交聯(lián)反應(yīng)在加熱和低PH的情況下會(huì)發(fā)生逆轉(zhuǎn)伤为，因此DNA與蛋白質(zhì)的交聯(lián)復(fù)合物的穩(wěn)定性也是一個(gè)值得關(guān)注的問(wèn)題咒循。

根據(jù)有無(wú)甲醛交聯(lián)步驟可將ChIP分為兩種類(lèi)型，一類(lèi)是存在甲醛交聯(lián)的ChIP,即X-ChIP(cross-linking and mechanical shearing ChIP);另一類(lèi)是無(wú)交聯(lián)存在的ChIP,即N-ChIP(native-ChIP)绞愚；相較于X-ChIP,N-ChIP有很多優(yōu)點(diǎn)：（1）高分辨率叙甸；（2）避免了甲醛交聯(lián)帶來(lái)的非特異性蛋白在DNA上的富集；（3）避免了甲醛交聯(lián)對(duì)抗抗原表位的遮蓋位衩；（4）減少了樣品損失裆蒸。由于使用MNase,N-ChIP只適用于研究組蛋白修飾，不能用于轉(zhuǎn)錄因子研究糖驴。

2. 酶斷裂法與超聲波打斷方法比較

常用的斷裂酶是MNase,即微球菌核酸酶僚祷，它能夠降解核小體連接區(qū)的DNA序列的核酸酶；MNase消化染色質(zhì)可以釋放出一個(gè)個(gè)獨(dú)立的核小體贮缕。MNase酶解法具有一定的局限性：（1）偏向于切割A(yù)/T堿基位點(diǎn)辙谜，使得核小體A/T富集區(qū)域表達(dá)量低于真實(shí)情況；（2）MNase不能在核小體邊界處精確切割感昼，導(dǎo)致染色體的開(kāi)放位置與真實(shí)情況存在差異装哆；（3）MNase偏向于消化脆性核小體；（4）MNase獲得的DNA片段相對(duì)較短抑诸，對(duì)后續(xù)樣品的PCR擴(kuò)增和檢測(cè)帶來(lái)了困難烂琴。

有研究認(rèn)為爹殊，超聲打斷不如酶裂解法溫和蜕乡，而且由于打斷的不均勻性，會(huì)導(dǎo)致測(cè)序結(jié)果背景噪音高梗夸，影響后續(xù)數(shù)據(jù)分析层玲。在選擇打斷方式時(shí)，（1）如果所研究的蛋白質(zhì)高豐度表達(dá)且與DNA結(jié)合緊密如組蛋白，那么樣本無(wú)需交聯(lián)辛块，可使用酶解法畔派；（2）若所研究的蛋白質(zhì)表達(dá)豐度較低或與DNA結(jié)合不緊密如轉(zhuǎn)錄因子等，最好用交聯(lián)試劑將樣本進(jìn)行固定润绵，穩(wěn)定蛋白質(zhì)和DNA形態(tài)线椰，這種情況用超聲破碎最好。

（二）關(guān)于ChIP-seq分析的高級(jí)工具

ChIP-seq數(shù)據(jù)可對(duì)不同的細(xì)胞類(lèi)型進(jìn)行分析尘盼，利用這些細(xì)胞類(lèi)型的信息來(lái)推斷基因組動(dòng)態(tài)信息或用一些實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)來(lái)注釋細(xì)胞類(lèi)型的表觀遺傳學(xué)圖譜憨愉。越來(lái)越多研究表明，表觀遺傳信息與基因表達(dá)和染色體構(gòu)象高度相關(guān)卿捎，可用于預(yù)測(cè)基因表達(dá)情況和染色體構(gòu)象配紫。在本節(jié)中，我們簡(jiǎn)要介紹有關(guān)組蛋白修飾的ChIP-seq分析的高級(jí)應(yīng)用工具午阵。

1. 表觀基因組的基因表達(dá)預(yù)測(cè)

通過(guò)ChIP-seq實(shí)驗(yàn)獲得的表觀遺傳信息來(lái)定量推斷基因表達(dá)水平躺孝，人們已經(jīng)開(kāi)發(fā)了各種基于機(jī)器學(xué)習(xí)的方法。例如底桂，（1）將線(xiàn)性回歸模型應(yīng)用于啟動(dòng)子位點(diǎn)的組蛋白修飾富集植袍，以預(yù)測(cè)CD4+T細(xì)胞中的基因表達(dá)；他們利用了19個(gè)組蛋白修飾戚啥，表明只需3個(gè)啟動(dòng)子位點(diǎn)修飾就足以模擬基因表達(dá)[1]奋单。（2）運(yùn)用非線(xiàn)性模型（如多元自適應(yīng)回歸線(xiàn)條（MARS）和隨機(jī)森林），繪制了七個(gè)人類(lèi)細(xì)胞系中的十一個(gè)組蛋白修飾和DNase I超敏反應(yīng)圖譜[2]猫十。這些模型僅考慮啟動(dòng)子位點(diǎn)的表觀遺傳模式览濒，而不考慮增強(qiáng)子位點(diǎn)信息。相反拖云，DeepExpression[3]利用HiChIP數(shù)據(jù)[4]（一種捕獲蛋白質(zhì)中心染色體環(huán)的高通量技術(shù)）來(lái)考慮增強(qiáng)子和增強(qiáng)子與啟動(dòng)子的相互作用贷笛。還有幾種使用卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（CNN）來(lái)預(yù)測(cè)基因表達(dá)[5]或差異基因調(diào)控模式的工具[6]。

2. 從表觀基因組數(shù)據(jù)預(yù)測(cè)染色質(zhì)相互作用

有大量研究表明宙项，增強(qiáng)子上的單堿基多態(tài)性會(huì)導(dǎo)致遺傳病和癌癥[7]乏苦，所以需要一種方法能夠定義不同細(xì)胞系上增強(qiáng)子的狀態(tài)。染色質(zhì)構(gòu)想捕獲實(shí)驗(yàn)（3C）延伸出了一些新技術(shù)：Hi-C[8]尤筐，HiChIP[4]和ChIA-PET[9]汇荐，他們可以捕獲到增強(qiáng)子與目的基因間的空間結(jié)構(gòu)。Hariprakash和Ferrari將探究基因和增強(qiáng)子相互作用的方法分為四類(lèi)：（1）基于相關(guān)性的方法估計(jì)所有增強(qiáng)子-啟動(dòng)子對(duì)的相互作用強(qiáng)度盆繁；（2）基于回歸性的方法假定多個(gè)增強(qiáng)子對(duì)單個(gè)基因有貢獻(xiàn)掀淘；（3）基于監(jiān)督學(xué)習(xí)和計(jì)分的方法可以整合多個(gè)ChIP-seq數(shù)據(jù)集和其他信息類(lèi)型。這些工具都專(zhuān)注于增強(qiáng)子-啟動(dòng)子相互作用油昂，但還有許多其他染色質(zhì)相互作用類(lèi)型革娄，例如增強(qiáng)子-增強(qiáng)子環(huán)和通過(guò)相分離產(chǎn)生的弱染色質(zhì)聚集[10]倾贰。而CITD[11]和DRAGON[12]分別使用小波變換和勢(shì)能函數(shù)從表觀遺傳數(shù)據(jù)中全面解析了三維基因組組織。

3. ChIP-seq數(shù)據(jù)的重建和去噪

ChIP-seq數(shù)據(jù)中的偏差和批次效應(yīng)對(duì)分析有很大影響拦惋。由于機(jī)器學(xué)習(xí)方法對(duì)訓(xùn)練數(shù)據(jù)中的噪聲很敏感匆浙，某些ChIP-seq樣本將被識(shí)別為中等質(zhì)量或被拒絕為低質(zhì)量數(shù)據(jù)（導(dǎo)致丟失數(shù)據(jù)）。如果生物樣品很珍貴（例如原代細(xì)胞和臨床樣品）厕妖，很難收集大量樣品首尼，“數(shù)據(jù)插補(bǔ)”方法可能就會(huì)適用。這些方法是利用來(lái)自其他緊密相關(guān)細(xì)胞類(lèi)型的表觀遺傳數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)降噪或重建言秸，“數(shù)據(jù)降噪”旨在通過(guò)識(shí)別和消除數(shù)據(jù)中的噪聲來(lái)改善現(xiàn)有的ChIP-seq樣本質(zhì)量饰恕。軟件Coda[13]可以編碼生成噪聲的過(guò)程，并使用卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)恢復(fù)ChIP-seq數(shù)據(jù)中的信號(hào)井仰÷袂叮“數(shù)據(jù)重建”旨在從計(jì)算機(jī)中的大型數(shù)據(jù)集中生成丟失的ChIP-seq數(shù)據(jù)。ChromImpute[14]是一個(gè)新的工具俱恶，可利用回歸樹(shù)使用十種最相關(guān)的細(xì)胞類(lèi)型從每個(gè)缺失實(shí)驗(yàn)中推斷出信號(hào)雹嗦。軟件PREDICTD[15]和Avocado[16]利用張量分解同時(shí)插入多個(gè)ChIP-seq數(shù)據(jù)。這些數(shù)據(jù)插補(bǔ)方法是實(shí)際ChIP-seq實(shí)驗(yàn)的潛在計(jì)算替代方法合是，并且可能為收集所有可能在生物學(xué)上不可能的細(xì)胞類(lèi)型和環(huán)境條件的表觀基因組數(shù)據(jù)開(kāi)辟道路了罪。盡管這種方法在計(jì)算上具有挑戰(zhàn)性，但來(lái)自各種細(xì)胞類(lèi)型的公共可用高質(zhì)量數(shù)據(jù)鼓勵(lì)實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)聪全。

（三）關(guān)于單細(xì)胞ChIP-seq分析

最近的研究表明泊藕，許多細(xì)胞類(lèi)型（包括正常的免疫細(xì)胞）在復(fù)雜的組織和腫瘤中起著重要的輔助功能。為了闡明發(fā)育過(guò)程中的這種細(xì)胞異質(zhì)性和細(xì)胞命運(yùn)軌跡难礼，人們已經(jīng)開(kāi)發(fā)了各種單細(xì)胞測(cè)定方法娃圆。其中，scChIP-seq可從低輸入樣本中以單細(xì)胞分辨率對(duì)組蛋白修飾和其他染色質(zhì)結(jié)合蛋白進(jìn)行全基因組分析蛾茉。最近讼呢，用于單細(xì)胞標(biāo)記和ChIP-seq庫(kù)制備的多種方法用于單細(xì)胞標(biāo)記和ChIP-seq文庫(kù)制備；這些方法使用微流體系統(tǒng)谦炬，Tn5轉(zhuǎn)座酶標(biāo)記悦屏，和ChIP-free的策略。

• 表. 單細(xì)胞ChIP-seq方法

1.基于微流體系統(tǒng)的分析

第一個(gè)scChIP-seq方法scDrop-ChIP [17]使用微流體系統(tǒng)進(jìn)行細(xì)胞標(biāo)記键思，并結(jié)合規(guī)范的ChIP方法在每個(gè)細(xì)胞中產(chǎn)生約800個(gè)非重復(fù)讀段础爬。最近開(kāi)發(fā)的微滴微流控方法[18]提供了更高的分辨率，每個(gè)細(xì)胞產(chǎn)生約10,000個(gè)非重復(fù)讀段吼鳞。這些方法的局限性是大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室通常無(wú)法使用專(zhuān)用的微流體裝置看蚜。

2.基于標(biāo)簽的分析

使用Tn5轉(zhuǎn)座酶的基于標(biāo)簽的文庫(kù)制備已廣泛用于各種NGS分析，包括ChIP-seq赖条。sc-itChIP-seq [19]在經(jīng)典的ChIP實(shí)驗(yàn)之前采用標(biāo)簽化技術(shù)進(jìn)行單細(xì)胞標(biāo)記和文庫(kù)制備失乾。此方法每個(gè)單元產(chǎn)生9000個(gè)非重復(fù)讀段。由于實(shí)驗(yàn)過(guò)程與規(guī)范的ChIP-seq方法相似纬乍，因此該方法比scDrop-ChIP更易于使用碱茁。

3.ChIP-free方法

scChIP-seq已經(jīng)開(kāi)發(fā)了幾種ChIP-free方法：?jiǎn)渭?xì)胞染色質(zhì)免疫裂解測(cè)序（scChIC-seq）[20]和單細(xì)胞uliCUT＆RUN [21]；它們是基于CUT＆RUN方法的[22]仿贬，采用MNase和蛋白A融合蛋白檢測(cè)具有特定抗體的裂解靶位點(diǎn)纽竣。這些方法每個(gè)細(xì)胞產(chǎn)生約4,100個(gè)非重復(fù)讀段，然后需要嚴(yán)格實(shí)驗(yàn)步驟來(lái)制備文庫(kù)茧泪，缺點(diǎn)是reads比對(duì)率比較低（~6％）蜓氨。另外還有三種類(lèi)似的方法被開(kāi)發(fā)：CUT＆Tag [23]，ACT-seq [24]和CoBATCH [25]队伟，這些方法使用Tn5轉(zhuǎn)座酶和蛋白A融合蛋白穴吹。在文庫(kù)制備過(guò)程中，在目標(biāo)蛋白結(jié)合在染色體上后嗜侮，融合蛋白捕獲一抗港令，然后激活Tn5轉(zhuǎn)座酶以在蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行標(biāo)記。這些方法的優(yōu)點(diǎn)是可以同時(shí)進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)檢測(cè)和文庫(kù)制備锈颗，從而大大減少了實(shí)驗(yàn)步驟和時(shí)間顷霹。此外，這些方法較少受到免疫沉淀步驟帶來(lái)的誤差击吱。此外淋淀，這些方法顯示約97％的比對(duì)率，每個(gè)細(xì)胞產(chǎn)生約12,000個(gè)非重復(fù)讀段覆醇。因此朵纷，這種ChIP-free方法具有進(jìn)行高通量和高質(zhì)量scChIP-seq分析的潛力。最后永脓，染色質(zhì)整合標(biāo)記和測(cè)序（ChIL-seq）[26]是另一種ChIP-free的方法柴罐，它是基于免疫染色的而非ChIP。該方法使用與dsDNA偶聯(lián)的第二抗體探針憨奸，該探針包含T7 RNA聚合酶啟動(dòng)子革屠，NGS接頭序列和Tn5結(jié)合序列。捕獲第一抗體后排宰，探針DNA序列通過(guò)Tn5轉(zhuǎn)座酶整合到目標(biāo)結(jié)合位點(diǎn)似芝。然后通過(guò)轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增整合區(qū)域，進(jìn)行RNA純化和文庫(kù)制備板甘。該方法可用于單細(xì)胞分析党瓮，但可能需要進(jìn)行幾次優(yōu)化才能實(shí)現(xiàn)高通量測(cè)序。將來(lái)將開(kāi)發(fā)其他scChIP-seq方法盐类，例如同時(shí)檢測(cè)多個(gè)組蛋白修飾和其他染色質(zhì)結(jié)合蛋白寞奸。這些研究將能夠捕獲每個(gè)細(xì)胞染色體上的基因調(diào)節(jié)因子并得知他們之間的相互作用關(guān)系呛谜。

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