1.微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（MSI）

• 1.1 微衛(wèi)星序列
  MS序列，是一些短而重復的DNA序列组底，串聯(lián)重復排列卿嘲，又稱短串聯(lián)重復（short tandem repeat,STR），常見類型為雙堿基CA/GA/GT或單堿基A/T等为迈。微衛(wèi)星序列以1-6bp為一個重復單元，重復次數(shù)不超過60次缺菌，人類基因組中有數(shù)以萬計的微衛(wèi)星位點葫辐，這些微衛(wèi)星位點近似均勻的分布在各個染色體上，所有的微衛(wèi)星序列約占整個基因組的3%伴郁，微衛(wèi)星序列按照重復序列的結構可分為簡單重復（由單一重復單元構成）及復合重復（有重復單元不同的多個重復序列構成）耿战，與DNA中的其他區(qū)域相比，微衛(wèi)星區(qū)域具有較高的突變率焊傅，其高突變率的直接表現(xiàn)是高度的多態(tài)性剂陡，也即不同的個體之間，或腫瘤組織及正常組織之間狐胎，微衛(wèi)星位點重復單元的重復次數(shù)存在差異鸭栖。
• 1.2 微衛(wèi)星不穩(wěn)定性
  微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（Microsatellite Instability，MSI）握巢，是指由于在DNA復制時插入或缺失突變引起的微衛(wèi)星（Microsatellite, MS）序列長度改變的現(xiàn)象晕鹊。在DNA的復制過程中，DNA聚合酶在遇到串聯(lián)重復序列時會發(fā)生“打滑”，引起微衛(wèi)星位點中核苷酸的插入或缺失溅话。而這一過程可以被錯配修復（mismatch repair,MMR）系統(tǒng)所識別并修復晓锻，若MMR基因發(fā)生啟動子區(qū)的高甲基化或編碼區(qū)的突變，導致其功能喪失飞几，則會無法及時修復微衛(wèi)星中自發(fā)的高頻長度變異带射，從而引起MSI。當DNA錯配修復功能（mismreprinter循狰，MMR）異常時，微衛(wèi)星的復制錯誤無法糾正并且連續(xù)積累券勺，使微衛(wèi)星的序列長度或堿基組成發(fā)生變化绪钥，這稱為微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（MSI），并使基因組表現(xiàn)出高突變表型关炼。在腫瘤中程腹，MMR功能缺陷通常是由MMR基因（MLH1，MSH2儒拂，MSH6和PMS2）和相關基因EPCAM的致病性突變引起的寸潦，或者可能是由MHL1啟動子區(qū)域的高甲基化引起的缺乏MLH1的表達導致。MS序列可以位于基因的重要非編碼區(qū)社痛，也可以位于基因的編碼區(qū)见转，多態(tài)性分布于整個基因組，個體差異大蒜哀。
  MSI現(xiàn)象于1993年被Jacobs等人在結直腸癌中首次發(fā)現(xiàn)斩箫。隨著針對MSI的研究深入，發(fā)現(xiàn)MSI現(xiàn)象不止存在于結直腸癌撵儿，在子宮內膜癌乘客、胃癌、肝細胞癌淀歇、乳腺癌等實體瘤中均有發(fā)生易核。

2.MSI檢測方法

目前檢測癌細胞中的MSI時，既可以通過檢測MMR基因缺失來確定是否發(fā)生MSI浪默，如依賴于免疫組化技術的蛋白水平檢測牡直，也可以直接檢測MSI的序列變化，如PCR（聚合酶鏈反應）檢測等的分子水平檢測浴鸿。

2.1 免疫組化方法（Immunohistochemistry, IHC）

常見的方法為采用免疫組織化學方法檢測腫瘤組織中錯配修復基因MLH1井氢、MSH2、MSH6及PMS2的表達岳链。任何一項錯配修復基因表達缺失花竞，被定義為MSI，否則即為微衛(wèi)星穩(wěn)定（MSS）。其中一個表達缺失則稱為低度微衛(wèi)星不穩(wěn)定(MSI-L)约急，2種或2種以上蛋白表達缺失為高度微衛(wèi)星不穩(wěn)定(MSI-H)零远。此方法檢測MSI相對較簡單，成本較低厌蔽。但存在一些問題牵辣，如使用抗體的不一致、病理醫(yī)生的閱片標準不一致等奴饮。

2.2 分子水平的檢測

• 2.2.1 聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction, PCR)技術
  目前主要采用多重熒光PCR結合毛細管電泳的方法纬向。通過PCR方法檢測特異的微衛(wèi)星重復序列擴增判定MSI狀態(tài)，比較腫瘤患者的標本組織與正常組織的位點突變情況戴卜。其比較的位點為美國國家癌癥研究所（NCI）推薦的5個微衛(wèi)星位點：BAT25逾条、BAT26、D5S346投剥、D2S123及D17S250师脂。其中≥2個位點發(fā)生改變判定為高度微衛(wèi)星不穩(wěn)定（MSI-H），僅1個位點發(fā)生改變判定為低度微衛(wèi)星不穩(wěn)定（MSI-L）江锨，無位點改變判定為微衛(wèi)星穩(wěn)定（MSS）吃警。有研究認為，二核苷酸重復序列的特異性和靈敏度比單核苷酸重復序列要低啄育，因此關于最適合MSI檢測的位點仍存在爭議酌心。Bacher等對266個微衛(wèi)星位點(其中包括單核苷酸、二核苷酸灸撰、四核苷酸以及五核苷酸微衛(wèi)星位點)檢測的敏感性及準確性進行評估谒府，提出了Promega分析系統(tǒng)，該系統(tǒng)使用五個單核苷酸微衛(wèi)星位點(BAT-25, BAT-26, NR-21, NR-24和MONO-27)及兩個五核苷酸微衛(wèi)星位點(Penta C和Penta D)檢測MSI浮毯。
  大量的實驗證實完疫，MMR免疫組化檢測結果與MS的PCR檢測結果有高度關聯(lián)性，靈敏度92%债蓝，特異性可達100%壳鹤。

該方法目前是檢測MSI的方法學“金標準”，但操作過程復雜饰迹，花費較高芳誓，且在結果判斷中會碰到以下問題，如熒光的過強或過少啊鸭、非特異性峰锹淌、不顯著的峰大小改變，雜合性缺失等赠制。

• 2.2.2 新一代測序方法（Next Generation Sequencing, NGS）
  近年來赂摆，隨著高通量測序平臺的廣泛應用，NGS平臺目標區(qū)域測序（即NGS panel）或全外顯子組測序（WES）或全基因組測序（WGS）開始應用于MSI檢測，使用計算工具來同時研究基因組上的大量微衛(wèi)星序列成為可能烟号，已報道的基于NGS平臺的MSI算法包括但不
  限于下表：

  
  
  基于NGS的MSI算法
  
  

  紀念斯隆·凱特琳癌癥研究中心（Memorial Sloan Kettering Cancer Center绊谭，MSK）的一項研究使用NGS方法對12,288例實體瘤病人進行檢測，判定MSI狀態(tài)汪拥，并用MSI-PCR/MMR-IHC進行了驗證达传。實驗證明, NGS方法較MSI-PCR方法具有更高的敏感性。

MSI檢測方法比對

MSI檢測方法學比對

3.MSI檢測的臨床意義

• 3.1 Lynch綜合征的篩查
  Lynch綜合征迫筑，亦稱遺傳非息肉病性結直腸癌（HNPCC）宪赶，是一種呈家族遺傳傾向的常染色體顯性遺傳病，由于MMR基因發(fā)生胚系突變所致脯燃，約占所有結直腸癌（Colorectal carcinoma, CRC）3%～5%逊朽。Lynch綜合征最突出的特點之一是攜帶者本人或家族成員可發(fā)生CRC及其他多種Lynch相關腫瘤。MSI是Lynch綜合征的特征性分子曲伊，約90%以上表現(xiàn)出MSI。同時并不是所有的MSI均是Lynch綜合征追他，在散發(fā)性CRC中也存在10%～15%的MSI坟募。
• 3.2 MSI與結直腸癌的預后
  臨床研究證實，MSI與結直腸癌的預后有著密切的關系邑狸。MSI-H結直腸癌患者相比MSS患者具有顯著的生存優(yōu)勢懈糯，臨床表現(xiàn)較差，但預后更好单雾。研究證實赚哗，針對Ⅱ/Ⅲ期結直腸癌患者，MSI-H患者的總生存期及無病生存期明顯延長硅堆。美國國家綜合癌癥網(wǎng)絡（National Comprehensive Cancer Network屿储，NCCN）發(fā)布的結直腸癌指南，建議MSI檢測應在所有結直腸癌史的病人中進行渐逃。
• 3.3 MSI與指導用藥
  研究證實够掠，MSI-H的結直腸癌Ⅱ期患者不能在氟尿嘧啶（5-FU）治療中獲益。同時因MSI-H的晚期結直腸癌患者通常具有PD-1及PDL-1等的高表達茄菊，可通過對PD-1/PD-L1的靶向抑制疯潭，促使機體免疫系統(tǒng)攻擊和殺滅腫瘤細胞。目前美國FDA已批準PD-1免疫治療單抗pembrolizumab面殖、ipilimumab和nivolumab用于具有錯配修復缺陷（dMMR）/MSI-H表型的轉移性結直腸癌（mCRC）的末線治療竖哩。除了mCRC的治療外，2017年5月脊僚，美國FDA批準了PD-1抗體pembrolizumab用于治療成人和兒童具有dMMR/MSI-H表型的沒有其他治療選擇的相叁，不可切除或轉移性實體瘤患者。
  《中國結直腸癌診療指南》（2010版）就明確了“Ⅱ期結直腸癌，有條件者建議檢測組織標本MMR或MSI钝荡，如為dMMR或MSI-H街立，不推薦氟尿嘧啶類藥物的單藥輔助化療”。在《中國結直腸癌診療指南》（2017版）的組織病理學檢查部分埠通，增加了MMR或MSI的檢測作為復發(fā)或轉移性結直腸癌的推薦檢測方法赎离，“確定為復發(fā)或轉移性結直腸癌時，推薦檢測腫瘤組織K-ras及N-ras基因端辱、BRAF基因梁剔、錯配修復蛋白表達或微衛(wèi)星狀態(tài)及其他相關基因狀態(tài)以指導進一步治療∥璞危”

4.相關檢測產(chǎn)品介紹

目前國際上已上市的產(chǎn)品有：

• 4.1 MSI-IVD Kit (FALCO)
  日本FALCO公司的MSI-IVD Kit已獲得日本厚生勞動省的批準上市荣病。該試劑盒采用PCR技術檢測癌組織中提取的基因組DNA中的MSI狀態(tài)，檢測7個微衛(wèi)星位點（五個單核苷酸微衛(wèi)星位點BAT-25, BAT-26, NR-21, NR-24和MONO-27及兩個五核苷酸微衛(wèi)星位點Penta C和Penta D）渗柿。該產(chǎn)品由日本FALCO公司與Promega公司合作開發(fā)个盆，作為伴隨診斷試劑，用于指導PD-1抗體pembrolizumab在局部晚期或轉移性癌癥患者中的應用朵栖。
• 4.2 VENTANA MMR IHC panel
  該產(chǎn)品采用IHC方法檢測經(jīng)福爾馬林固定石蠟包埋的結直腸癌組織切片中的四種MMR蛋白MLH1颊亮、MSH2、MSH6陨溅、PMS2终惑，及BRAF V600E
  突變蛋白。用于Lynch綜合征的輔助診斷门扇，同時檢測BRAF V600E突變蛋白用于散發(fā)性CRC及Lynch綜合征的輔助鑒別診斷雹有。此產(chǎn)品通過De Novo途徑在美國上市。
• 4.3 MSK-IMPACTTM
  2017年11月16日臼寄，美國FDA批準紀念斯隆·凱特琳癌癥研究中心（Memorial Sloan Kettering Cancer Center霸奕，簡稱MSK）基于二代測序技術的癌癥基因檢測分析平臺MSK-IMPACTTM。該產(chǎn)品能夠一次對病人腫瘤468個基因的突變進行檢測吉拳，并且可以檢測MSI基因組特征铅祸。該產(chǎn)品僅限于在MSK中進行使用，其檢測結果不與任何藥物聯(lián)用合武。該產(chǎn)品的MSI的檢測性能通過對10,900名患有66種不同類型晚期實體瘤患者的研究進行確定临梗。
• 4.4 FoundationOne CDx (F1CDx)
  2017年11月30日，美國FDA批準了Foundation Medicine公司針對多種實體瘤的二代測序的體外檢測產(chǎn)品—FoundationOne CDx（F1CDx）稼跳。該產(chǎn)品僅允許在Foundation Medicine公司進行檢測盟庞。這款產(chǎn)品除了可檢測5種腫瘤中的324個基因的突變，還可以檢測MSI和腫瘤突變負荷（TMB）兩個基因組特征汤善，是FDA批準的首款獲得突破性認定的癌癥NGS體外診斷檢測產(chǎn)品什猖。