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聽張旭東老師的課

發(fā)展情形

• 蛋白質(zhì)組學(xué)瘟忱、代謝組學(xué)技術(shù)不成熟玻靡，費(fèi)用高 → 大量做轉(zhuǎn)錄組學(xué)(間接)
• 表達(dá)芯片已經(jīng)大部分被轉(zhuǎn)錄組測(cè)序替代蹄溉，表達(dá)芯片優(yōu)劣勢(shì)奄薇，有可能芯片上沒有

簡(jiǎn)單的分析流程

測(cè)序數(shù)據(jù)(上百G) --標(biāo)準(zhǔn)分析(需要服務(wù)器)→ 表達(dá)矩陣(幾M) --數(shù)據(jù)挖掘(PC/R語言)→ 統(tǒng)計(jì)圖表(幾M)

表達(dá)數(shù)據(jù)挖掘

• 三張表

① 表達(dá)矩陣：每行一個(gè)gene,每列一個(gè)樣本sample（可以在GEO數(shù)據(jù)庫下載）

② 樣本信息表：每行一個(gè)樣本窿冯，每列一個(gè)表型特征（臨床信息妒御、表型特征布疙、生化指標(biāo)等）

③基因信息表：每行一個(gè)基因姆钉，每列一個(gè)信息

• 研究目的
  大多數(shù)為找到表型背后的分子機(jī)制
• 注
  RNA測(cè)序數(shù)據(jù)與芯片測(cè)序數(shù)據(jù)可以合并分析，但不能直接合并听诸，相當(dāng)于是個(gè)分析各的坐求，再看兩個(gè)分析找到的規(guī)律是否一致

分析方法

尋找關(guān)鍵基因和關(guān)鍵樣本

• 差異表達(dá)分析：哪些基因在兩組樣本中有明顯表達(dá)差異？

  • 差異表達(dá)分析得到的表格中：
    FC(Folder change) 該基因在所檢測(cè)的兩組樣品中表達(dá)量相差多少倍
    log2FC
    Pval(P value) 假設(shè)檢驗(yàn)
    Padj 多重假設(shè)矯正之后的P value → 矯正之后的P value小于0.05為有顯著差異
    • Questions
      ① 如何篩選差異基因晌梨，只用P value<0.05行不行桥嗤？
      不行，還要FC>2 或 |log2FC|>1
      ② 該設(shè)計(jì)多少個(gè)生物學(xué)重復(fù)仔蝌？
      最少3個(gè)泛领，最好有7、8個(gè)
      ③ 是否生物學(xué)重復(fù)越多敛惊，鑒定到的差異表達(dá)基因就越多渊鞋？
      是。重復(fù)越多瞧挤，更多差異小的基因被識(shí)別
      ④ DESeq2 鑒定到500個(gè)差異基因锡宋，換edgeR有2000個(gè)，哪個(gè)對(duì)特恬？
      都對(duì)执俩，選擇合適的，不同算法模式不一樣癌刽，要選擇適合目標(biāo)測(cè)序結(jié)果的差異表達(dá)分析模型役首。差異表達(dá)基因少可以考慮換個(gè)模型，換個(gè)算法妒穴。
  • 差異表達(dá)分析結(jié)果可視化
    • 火山圖 左上角宋税、右上角差異越大
    • Heatmap 表達(dá)量矩陣可視化
    • Question
      ① 是否差異越大的基因越該重點(diǎn)關(guān)注
      否，很多是已經(jīng)研究透徹的基因讼油；可能只是結(jié)果杰赛，不是原因
      ② 差異表達(dá)基因過多或過少該如何調(diào)整？
      差異表達(dá)分析的基礎(chǔ)是假設(shè)檢驗(yàn)(t檢驗(yàn))矮台，假設(shè)檢驗(yàn)涉及到概率模型乏屯，有可能當(dāng)前假設(shè)的概率模型并不適合當(dāng)前實(shí)驗(yàn)結(jié)果根时，可以選擇其他分析軟件，或調(diào)整參數(shù)辰晕，更換概率模型蛤迎，從而達(dá)到這種目的。

• 樣本聚類分析：探索樣本之間的關(guān)系含友，鎖定關(guān)鍵樣本替裆，之后再做差異分析。

  • 樣本間相關(guān)系數(shù)：用來描述樣本表達(dá)模式的相似程度
    組間差異大窘问，組內(nèi)差異小 → 正常辆童，反之，不正常惠赫，可能需要重做把鉴。
  • 基因間相關(guān)系數(shù)：找到與已知基因關(guān)聯(lián)基因
    表達(dá)模式相似的基因
  • 相關(guān)系數(shù)：三種常用計(jì)算方法
    Pearson相關(guān)系數(shù)
    Spearman相關(guān)系數(shù)
    Kendel相關(guān)系數(shù)
    通常會(huì)關(guān)心相關(guān)系數(shù)在0.75 - 1 之間的值
  • 注：
    性別 —— Kendel相關(guān)系數(shù)
    腫瘤分期 —— Spearman相關(guān)系數(shù)

• 聚類分析和WGCNA：探索基因與表型的關(guān)系

  • 基因與表型可以做相關(guān)性分析，但是對(duì)于一個(gè)表型儿咱，不止一個(gè)基因與之相關(guān)庭砍，因此采取： 對(duì)所有基因聚類 → 用聚類后的基因簇(cluster)與表型做相關(guān)性分析
  • WGCNA分析(加權(quán)共表達(dá)分析)
    ① 模塊構(gòu)建(基因聚類)
    ② 性狀與模塊相關(guān)分析 —— 篩選出與該表型相關(guān)的gene cluster —— 對(duì)于該性狀混埠，cluster中的基因不是同等重要怠缸，用Cytoscape繪出網(wǎng)絡(luò)圖,確定在中心位置的為關(guān)鍵gene
    ③ 鑒定Hub基因
  • TOM矩陣(拓?fù)渲丿B矩陣)
  • 注
    大部分人該過程在PC上完成，因?yàn)楹芎膬?nèi)存岔冀，很多都不得不濾除一些差異很小的基因

• 主成分分析(PCA)

  • 聚類分析和主成分分析都是降維分析
  • 對(duì)原來數(shù)據(jù)進(jìn)行PC線性變換凯旭，通過n個(gè)PC各項(xiàng)加權(quán)概耻，將m項(xiàng)降維至n項(xiàng)(n<m)
  • 要考慮的問題：
    ① 哪個(gè)PC最能體現(xiàn)樣品的差異使套？
    ② 假如你關(guān)心某項(xiàng)功能，應(yīng)該重點(diǎn)關(guān)注哪個(gè)PC?
    ③ 重點(diǎn)關(guān)注哪個(gè)PC,可以完成聚類
  • 結(jié)果圖：
    hub PC：bioplot
    hub PC：表型關(guān)聯(lián)
    hub genes：loadings plot

功能分析

• 富集分析：差異基因是否顯著集中在某個(gè)功能分類上鞠柄？
  • 功能分類：GO分類侦高、Pathway分類
  • 富集分析結(jié)果
    GO分類ID
    Description 分類功能描述
    GeneRatio 差異基因中有多少富集在此pathway上
    BgRatio 背景，所有基因中有多少富集在此Pathway上
    Pvalue 比較以上兩者厌杜，得到Pvalue
    P.adjust P值矯正
  • 最佳實(shí)踐：通過ClusterProfiler軟件包做
• 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析(PPI)
  • 通過已有數(shù)據(jù)庫查看基因是否有關(guān)聯(lián)

表達(dá)驗(yàn)證

• 目的：驗(yàn)證測(cè)序奉呛、芯片是否靠譜；測(cè)序樣本生物學(xué)重復(fù)數(shù)量少夯尽，可以在表達(dá)驗(yàn)證掰回來瞧壮，驗(yàn)證時(shí)多點(diǎn)生物學(xué)重復(fù)，增強(qiáng)說服力匙握。
• 方法
  qPCR驗(yàn)證
  數(shù)據(jù)庫檢索數(shù)據(jù)驗(yàn)證(腫瘤數(shù)據(jù)庫TCGA咆槽、正常人數(shù)據(jù)庫GTEx、將兩者結(jié)合在一起的數(shù)據(jù)庫)
• 功能：證明相關(guān)性圈纺，但還不能證明這些基因就有這個(gè)功能

功能驗(yàn)證

• 實(shí)驗(yàn)：
  敲除秦忿、敲低
  過表達(dá)
• 人類疾猜笊洹：生存分析

分子機(jī)制

TCGA等多組學(xué)關(guān)聯(lián)分析

• 序列變異
• 表觀遺傳修飾
• 轉(zhuǎn)錄調(diào)控