# 需要使用python環(huán)境的包皿伺，我都放在miniforge2/pkgs文件夾里面了，我也不知道不放里面解壓有沒有影響
tar -vxzf parallel-fastq-dump-0.6.3-py36_1.tar.bz2
# 配置環(huán)境
vim ~/.zshrc
# export PATH="/Users/用戶名/miniforge2/pkgs/parallel-fastq-dump-0.6.3-py36_1/bin:$PATH"
source ~/.zshrc
# 查看是否安裝成功
conda list

2. 使用parallel-fastq-dump解壓sra文件
雙端的單測數(shù)據(jù)一般都生成3個fastq文件拍柒，分別是I1（index文件）心傀，R1（細(xì)胞標(biāo)簽read文件）和R2（單個細(xì)胞內(nèi)測序文件），后續(xù)分析主要用到R1和R2具體可參考http://www.reibang.com/p/dadd202c34be

# 即便使用parallel-fastq-dump 8線程拆讯，20幾G的sra文件也用了半個多小時
parallel-fastq-dump --sra-id SRR17165228 --threads 4 --outdir ../rawfq/ --split-files --gzip
# 如果測序文件只是幾個G（細(xì)胞量少吧）脂男，可以使用批量程序掛機(jī)
ls *.sra | while read id
do ( nohup parallel-fastq-dump -t 72  -O ../rawfq/ --split-files --gzip -s $id &)
done
# 沒有試fasterq-dump，雖然它也支持多線程种呐，但不支持gzip壓縮宰翅，本例數(shù)據(jù)太大，應(yīng)該不夠空間存放爽室。汁讼。fastq-dump、fasterq-dump和parallel-fastq-dump區(qū)別和使用可以參考http://www.reibang.com/p/97e7a70aaf79

五、fastq文件比對并輸出Counts文件

1. 安裝STAR

https://github.com/alexdobin/STAR
我遇到的主要問題包括：
①git clone速度慢→可以通過GitHub Desktop進(jìn)行下載
②gcc編譯→修改編譯環(huán)境嘿架，參考https://blog.csdn.net/qq_33957603/article/details/131757260
③-mavx2報錯→source/Makefile文件里修改為CXX_SIMD_FLAGS=-march=native
ps. 更新了2.7.11a版本似乎可以使用zip下載了瓶珊，同時makefile文件里面也不存在“CXX_SIMD_FLAGS”了，應(yīng)該已經(jīng)解決Mac安裝該軟件時候-mavx2報錯問題耸彪。

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2. 建立比對索引

STAR --runMode genomeGenerate --genomeDir ~/Downloads/Reference/hg38 --genomeFastaFiles ~/Downloads/Reference/hg38/GRCh38.p14.genome.fa --sjdbGTFfile ~/Downloads/Reference/hg38/gencode.v44.annotation.gtf

3. 下載barcodes

STARsolo與普通的轉(zhuǎn)錄組比對區(qū)別在于你需要在比對時加上whitelist伞芹，參考http://www.reibang.com/p/b2076d670558
barcodes是細(xì)胞的標(biāo)簽序列文件，使用10XGenomics試劑盒產(chǎn)生的數(shù)據(jù)蝉娜，可以從10XGenomics處下載barcodes
https://github.com/10XGenomics/cellranger/tree/master/lib/python/cellranger/barcodes
本例用到的是3M-february-2018.txt

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4. 運(yùn)行單細(xì)胞比對

先解壓fastq.gz文件解壓到移動硬盤（其實(shí)上面可以用faster-dump生成fastq文件唱较，這里就不需要解壓了，主要還是硬盤容量不夠召川，fastq緩沖文件會占用硬盤空間）
盡量刪除占用電腦硬盤的文件南缓，因?yàn)閎am文件比fastq文件大幾倍，本例生成的bam文件200G左右（請大佬們教我怎么將緩沖文件也保存到移動硬盤荧呐，可能可以解決這個電腦硬盤不夠的問題）

STAR --runThreadN 16 \ #多線程汉形，所以比cellrange快，但是Mac本來也用不了cellrange倍阐，不知道修改編譯環(huán)境后能不能安裝获雕，未嘗試   
--genomeDir ../../Reference/hg38 \ #比對索引目錄
--readFilesIn *_3.fastq *_2.fastq \ #見上述3為R2文件，2為R1文件收捣，starsolo需要先比對R2文件，再通過R1文件分配到單細(xì)胞里面去
--soloType CB_UMI_Simple \ #10X的單細(xì)胞測序用這個one UMI and one Cell Barcode of xed length in read2, e.g. Drop-seq and 10X Chromium
--soloCBwhitelist ../../Reference/barcodes/3M-february-2018.txt \ #barcodes文件
--soloBarcodeReadLength 0 #默認(rèn)是1庵楷，但本例報錯罢艾，可能與添加了接頭序列導(dǎo)致與barcodes文件的堿基數(shù)不匹配

starsolo還可以根據(jù)不同的比對文件使用單細(xì)胞測序數(shù)據(jù)進(jìn)行多種分析，例如ncRNA尽纽、exon可變剪接等咐蚯，參考文章先保存在這了https://mp.weixin.qq.com/s/XoXBq6OMkghlhsg4yurHJA

5. 生成進(jìn)行下游分析的文件啦

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后話

這次白嫖花了半個月時間，希望后面再白嫖需要上游分析的測序數(shù)據(jù)弄贿，可以少花些時間春锋，畢竟代碼這東西用著用著就又報錯了??????