質(zhì)譜流式細(xì)胞技術(shù)（mass cytometry漆诽，MC）就是將電感耦合等離子體質(zhì)譜（ICP-MS）應(yīng)用到單個(gè)細(xì)胞的分析寝蹈，原理是用純化的單元素同位素標(biāo)記抗體，然后使用ICP-MS檢測(cè)該元素離子峰窄刘。該技術(shù)融合了流式細(xì)胞分選儀和ICP-MS拘泞。操作流程簡(jiǎn)單恨统，如圖1所示叁扫，首先細(xì)胞用帶有金屬元素（一般是鑭系金屬）的特異性抗體標(biāo)記3-4，然后被送入質(zhì)譜流式細(xì)胞儀畜埋，細(xì)胞以單個(gè)細(xì)胞液滴狀態(tài)被霧化后進(jìn)入高溫等離子體莫绣，產(chǎn)生自由原子，四級(jí)桿選擇只通過鑭系金屬質(zhì)量范圍內(nèi)的離子悠鞍，去除其余離子对室，利用飛行時(shí)間質(zhì)譜（TOF mass spectrometry）檢測(cè)鑭系金屬離子的相對(duì)信號(hào)強(qiáng)度。質(zhì)譜流式細(xì)胞儀由多倫多大學(xué)的研究人員首先研發(fā)出來咖祭，第一臺(tái)商品化的質(zhì)譜流式細(xì)胞儀名為Cytometry by Time-Of-Flight (CyTOF)掩宜，相關(guān)抗體試劑由DVS Sciences公司生產(chǎn)和銷售。

傳統(tǒng)流式細(xì)胞術(shù)用熒光基團(tuán)作為報(bào)告分子么翰，通過對(duì)發(fā)射光強(qiáng)度定量以確定目標(biāo)分子的表達(dá)量牺汤，但熒光基團(tuán)發(fā)射譜常有重合，尤其是在同一個(gè)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行多參數(shù)測(cè)量的情況下浩嫌，難以區(qū)分多個(gè)熒光基團(tuán)檐迟。質(zhì)譜流式細(xì)胞技術(shù)使用單一分子量的穩(wěn)定鑭系金屬代替熒光基團(tuán)作為報(bào)告分子，元素質(zhì)譜分析儀能夠通過分子量準(zhǔn)確區(qū)分不同原子質(zhì)量码耐，并且不同鑭系金屬質(zhì)量沒有信號(hào)重疊追迟，增加了定量的準(zhǔn)確性。

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目前骚腥，質(zhì)譜流式細(xì)胞技術(shù)可以同時(shí)對(duì)51個(gè)靶蛋白進(jìn)行檢測(cè)敦间，每秒檢測(cè)1000個(gè)細(xì)胞，平均每天可檢測(cè)100個(gè)樣品束铭，最低檢測(cè)限為100個(gè)拷貝分子每瞒，已經(jīng)過驗(yàn)證的鑭系金屬標(biāo)記抗體種類超過400種；除常規(guī)蛋白外纯露，質(zhì)譜流式細(xì)胞技術(shù)還可用于蛋白翻譯后修飾1剿骨，蛋白降解產(chǎn)物5，檢測(cè)細(xì)胞存活率埠褪，細(xì)胞大小浓利，mRNA轉(zhuǎn)錄子表達(dá)量6挤庇，DNA合成速率7以及蛋白酶活性8等的測(cè)定。

多路質(zhì)譜流式細(xì)胞技術(shù)

正如蛋白質(zhì)組學(xué)中的非標(biāo)記定量贷掖，質(zhì)譜流式細(xì)胞技術(shù)對(duì)靶點(diǎn)的定量準(zhǔn)確性也受到不同儀器離子化效率的差異嫡秕、儀器狀態(tài)等的影響；同時(shí)苹威，傳統(tǒng)的質(zhì)譜流式細(xì)胞技術(shù)每次只能檢測(cè)一個(gè)樣品昆咽，通量較低。因此牙甫，質(zhì)量標(biāo)簽細(xì)胞條碼技術(shù)（mass-tag cellular barcoding掷酗，MCB）應(yīng)運(yùn)而生。

細(xì)胞經(jīng)過藥物等處理后窟哺，用多聚甲醛固定后泻轰，使用MCB試劑對(duì)不同樣本的細(xì)胞進(jìn)行條形碼標(biāo)記，然后將不同樣本混合后進(jìn)行常規(guī)質(zhì)譜流式細(xì)胞分析前處理和檢測(cè)且轨。最終通過檢測(cè)條形碼對(duì)應(yīng)的元素離子浮声，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行樣品歸類。

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圖2. 多路質(zhì)譜流式細(xì)胞技術(shù)

多路質(zhì)譜流式細(xì)胞技術(shù)實(shí)驗(yàn)步驟如圖2所示旋奢，不同處理的樣本經(jīng)過甲醛固定泳挥，使用不同mDOTA分子對(duì)不同樣本進(jìn)行標(biāo)記，然后進(jìn)行常規(guī)的質(zhì)譜流式細(xì)胞分析的前處理和檢測(cè)至朗。

這里使用的mDOTA分子是一個(gè)雙功能化合物羡洁，一端可以螯合金屬離子，一端則可以和細(xì)胞中蛋白上的自由巰基以共價(jià)鍵形式結(jié)合（如圖3所示）爽丹，一個(gè)mDOTA分子可以螯合一個(gè)鑭系金屬元素原子筑煮，那為什么叫barcode呢？ Barcode 就是指可以同時(shí)添加多種被鑭系金屬元素螯合的mDOTA分子粤蝎，在CyTOF中共價(jià)鍵被打碎后真仲，每種鑭系金屬元素的峰即可形成有和無兩種情況，使用的鑭系金屬元素螯合的mDOTA試劑的種類越多初澎，最終可組成的條形碼種類越多秸应，如圖4所示，使用7種鑭系金屬元素螯合mDOTA試劑碑宴，可以組成2的7次方種條形碼软啼，即可以同時(shí)標(biāo)記128個(gè)樣品。 MCB的使用延柠，可以對(duì)多個(gè)樣本同時(shí)進(jìn)行單細(xì)胞定量分析祸挪，增加了質(zhì)譜流式細(xì)胞分析技術(shù)的分析通量，并且增加了相對(duì)定量的準(zhǔn)確性贞间。 本文一開始提到的那篇Cell Stem Cell的文章贿条，就是利用MCB技術(shù)雹仿，在單細(xì)胞層面研究人源紅細(xì)胞生成過程中內(nèi)源轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)和調(diào)控。

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圖3. mDOTA分子反應(yīng)原理

細(xì)胞使用雙功能分子mDOTA（maleimido-mono-amide- DOTA）以共價(jià)鍵形式進(jìn)行標(biāo)記整以。mDOTA一端可以螯合稀土元素胧辽，一端可以和細(xì)胞內(nèi)的蛋白的巰基反應(yīng)。

但是MCB存在一定的缺陷公黑，首先在每次儀器校正后邑商，質(zhì)譜流式細(xì)胞儀的離子檢測(cè)靈敏度都會(huì)發(fā)生變化，盡管可以用內(nèi)參進(jìn)行校正凡蚜，將樣品混合后檢測(cè)會(huì)降低樣品之間的變化程度人断； 其次，MCB使用鑭系金屬元素和后期使用的抗體耦連的鑭系金屬不能相同番刊，因此MCB的使用縮小了后續(xù)標(biāo)記抗體的選擇范圍。 因此影锈，后來基于鈀元素的MCB試劑被進(jìn)一步發(fā)展出來11芹务。 使用鈀元素的6個(gè)同位素原子進(jìn)行MCB分子的構(gòu)建有以下兩點(diǎn)優(yōu)勢(shì)： 首先，鈀元素因?yàn)楹蜆?biāo)記抗體的試劑（Diethylene triamine pentaacetic acid (DTPA)-based polymer）不兼容鸭廷，抗體標(biāo)記不會(huì)使用鈀元素枣抱，因此MCB分子使用鈀元素不會(huì)干擾后續(xù)標(biāo)記抗體的選擇； 第二辆床，Pd有6個(gè)穩(wěn)定同位素佳晶，102, 104, 105, 106, 108和110 amu, 純度很高，分別為91%, 96%, 98%, 99%, 99%和99%讼载，這些同位素和其他鑭系金屬元素質(zhì)量相差甚遠(yuǎn)轿秧，不會(huì)影響后續(xù)的抗體耦連的鑭系金屬元素的檢測(cè)。

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圖4. MCB形成原理

使用七種鑭系金屬元素螯合mDOTA試劑咨堤，按圖中分布添加mDOTA試劑菇篡，可以組成2的7次方種條形碼，即可以同時(shí)標(biāo)記128個(gè)樣品一喘。

質(zhì)譜流式細(xì)胞技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)

最后我們簡(jiǎn)單說一下這個(gè)技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)驱还。優(yōu)點(diǎn)是可同時(shí)檢測(cè)的通道比較多，現(xiàn)在可以做到同時(shí)檢測(cè)51個(gè)目標(biāo)蛋白凸克；可操作性強(qiáng)议蟆，試劑都是商品化的；速度雖然比不上流式細(xì)胞儀（每秒10000個(gè)細(xì)胞）萎战，但也并不慢咐容，每秒可檢測(cè)1000個(gè)細(xì)胞；成本低蚂维，平均每個(gè)細(xì)胞測(cè)量成本僅需0.005美分疟丙，對(duì)比單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)每個(gè)細(xì)胞平均22美元颖侄，可以說是相當(dāng)便宜了。

當(dāng)然享郊，就目前來看览祖，這個(gè)技術(shù)還存在不少的不足之處。 首先炊琉，細(xì)胞在分析中被霧化并離子化展蒂，在分析后不能保留完整的活細(xì)胞狀態(tài)； 其次苔咪，靈敏度低于熒光基團(tuán)锰悼，不能檢測(cè)極低水平表達(dá)的分子，檢測(cè)的動(dòng)態(tài)范圍最多只能達(dá)到3-4倍团赏，而熒光基團(tuán)的檢測(cè)范圍則可到50倍左右箕般；第三，不同儀器之間的離子化效率不同舔清，需要通過摻入聚苯乙烯珠子進(jìn)行信號(hào)強(qiáng)度的校正丝里，實(shí)現(xiàn)同一個(gè)儀器的數(shù)據(jù)的比較； 第四体谒，和基于熒光基團(tuán)的流式細(xì)胞技術(shù)一樣杯聚，質(zhì)譜流式細(xì)胞技術(shù)仍然不能檢測(cè)小分子代謝產(chǎn)物，并且不能對(duì)一個(gè)細(xì)胞進(jìn)行連續(xù)的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)抒痒； 最后幌绍，也是最重要的一點(diǎn)，不能對(duì)蛋白組中的所有蛋白進(jìn)行監(jiān)測(cè)故响，只能對(duì)特定目標(biāo)蛋白進(jìn)行檢測(cè)傀广，因此需要更為嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。

不管怎樣彩届，質(zhì)譜流式細(xì)胞技術(shù)還在不斷地發(fā)展和改進(jìn)主儡，我們能利用這個(gè)技術(shù)解決的問題也越來越多。希望通過這次對(duì)質(zhì)譜流式細(xì)胞技術(shù)的系統(tǒng)性介紹惨缆，也能為大家目前面臨的問題提供一點(diǎn)新思路糜值，為大家的課題添磚加瓦。（來源清華大學(xué)蛋白質(zhì)研究技術(shù)中心蛋白質(zhì)化學(xué)與組學(xué)平臺(tái)）

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