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5.1 原核與真核生物復(fù)制叉的區(qū)別Prokaryotic Verus Eukaryotic Replication Forks
原核與真核生物復(fù)制叉的區(qū)別
5.2 DNA起始的介紹
origin of replication: DNA開始解鏈以及DNA開始合成的物理位置
origin efficiency: 細胞分裂時復(fù)制起點啟動的百分比
復(fù)制子replicon: 源于一個起點的復(fù)制叉生成的全部DNA區(qū)域
復(fù)制子模型replicon Model=復(fù)制基因replicator+起始子initiator
復(fù)制基因replicator: 啟動染色體復(fù)制所必須的DNA序列缀去。它不等于復(fù)制起點缰犁。
起始子initiator:能夠識別復(fù)制基因或辖，從而激活復(fù)制起始的蛋白質(zhì)
5.3 Cell Cycle Terms
5.4Cell Cycl
5.5 復(fù)制起點Origins of Replication
發(fā)生于細胞分裂周期的S期。
復(fù)制起點。大腸桿菌只有一個较店；人類有約30000個復(fù)制起點
5.6High Throughput Assays for Origins of Replication
如何尋找復(fù)制起點雷客？
- map long leading strand DNAs
5.7DNA Sequencing and Interpreting Results for Nascent Leading Strand Detection新生的前導(dǎo)鏈檢測
對生成的新生的前導(dǎo)鏈檢測進行深度測序
優(yōu)點是不需要先驗知識
缺點是分辨率低
5.8Nascent Okazaki Fragment Origin Mapping
構(gòu)建新生的岡崎片段圖譜，也是用于尋找復(fù)制起點的方法
需要將單鏈轉(zhuǎn)換為雙鏈進行測序
5.9Analyzing Nascent Okazaki Fragment Origin Mapping Data
怎樣解釋上一節(jié)的數(shù)據(jù)牺堰？
6.1復(fù)制時序分析Replication Timing Assays
也是用于尋找復(fù)制起點的方法拄轻。
6.2Replication Timing Assays Continued
6.3 定位復(fù)制基因方法一：基于質(zhì)粒的方法
用限制性內(nèi)切酶EcoR1將質(zhì)粒的復(fù)制基因除去
質(zhì)粒上同時帶有遺傳篩選的selectable marker；用ECOR1酶切g(shù)enomic DNA成為片段伟葫，然后把這些片段連接到質(zhì)粒上
由此可以構(gòu)建攜帶不同片段的質(zhì)粒哺眯，稱為基因文庫library，之后將其transform進入宿主細胞扒俯，然后放入培養(yǎng)皿中進行遺傳篩選奶卓；比如marker 基因是ura3, 則放在缺乏uracil的培養(yǎng)基中，則只有攜帶ura3+復(fù)制基因的質(zhì)粒的細胞能存活撼玄，將這些存活的細胞菌落拿去測序夺姑。那么復(fù)制基因比如包含在細胞內(nèi)的質(zhì)粒當(dāng)中
6.4 定位復(fù)制基因方法二：突變定位。實現(xiàn)對復(fù)制基因的準確定位
第一行是包含復(fù)制基因的DNA掌猛，將其分段突變?nèi)缦旅嫠菊嫡恪Ｈ缓鬁y其replicator activity, 發(fā)現(xiàn)方括號內(nèi)的基因沒有活性眉睹，所以這兩塊基因是復(fù)制基因所necessary的，再單獨表達這兩塊基因如最后一行所示废膘，若有活性竹海，則說明是sufficient的
6.5 Isolating and Identifying Replication Proteins
對于origins of defined sequences來說，包含兩個組分： 丐黄、
起始子結(jié)合位點replication initiation site+一段DNA容易解鏈的區(qū)域easily unwound DNA斋配；真核中還包含第三個組分：核小體
三種生物的replication initiation site、easily unwound DNA和initiator binding site
那么如何鑒定DNA復(fù)制蛋白呢灌闺？第一種方法如下
從活細胞中提取蛋白復(fù)合物艰争，經(jīng)過陰離子交換anion exchange，經(jīng)過梯度分離獲得A桂对、B甩卓、C、D四個組分蕉斜，將其自由組合逾柿，發(fā)現(xiàn)A+B+D可以激活復(fù)制，而它們也是混合物宅此，需要進一步細分机错，以B為例，如下圖所示
將B細分為B1诽凌、B2毡熏、B3、B4四份侣诵，發(fā)現(xiàn)A+B2+B3+D可以發(fā)揮作用痢法，再次細分B2，依次循環(huán)
鑒定DNA復(fù)制蛋白的第一種方法比較復(fù)雜杜顺，第二種方法是采用遺傳篩選鑒定DNA復(fù)制相關(guān)蛋白
