近年來(lái)拨脉，空間基因表達(dá)技術(shù)得到了迅速的發(fā)展哆姻，其中最成熟的商業(yè)化平臺(tái)是來(lái)自10X Genomics的Visium，它們?cè)试S我們?cè)谛螒B(tài)學(xué)背景下進(jìn)行基因表達(dá)譜分析玫膀∶В空間轉(zhuǎn)錄組被Nature雜志評(píng)為2020年度技術(shù)，一時(shí)間風(fēng)光無(wú)兩帖旨。其實(shí)回顧起來(lái)箕昭，我們對(duì)生物體內(nèi)空間或原位信息上的癡迷異一點(diǎn)也不亞于對(duì)宇宙的好奇。技術(shù)允許的早期我們就開(kāi)始這樣做了解阅。
去年就有注意到加州理工（Caltech）大學(xué)Lambda Moses和Lior Pachter老師在寫(xiě)的在線(xiàn)電子書(shū)：Museum of Spatial Transcriptomics（2020-12-1）落竹。書(shū)中把空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)分為前傳時(shí)代（Prequel era）和當(dāng)下時(shí)代（Current era），從技術(shù)應(yīng)用瓮钥，數(shù)據(jù)分析筋量，數(shù)據(jù)庫(kù)等方面進(jìn)行了系統(tǒng)的文獻(xiàn)分析烹吵，為我們展開(kāi)空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)發(fā)展的歷史畫(huà)卷。本文就是在本書(shū)的基礎(chǔ)上整理而來(lái)桨武，我們感興趣的問(wèn)題有：
- 空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)為什么會(huì)分為兩個(gè)時(shí)代肋拔？
- 在早期它是什么樣子的？
- 兩個(gè)時(shí)代一脈相承的東西是什么呀酸？
- 當(dāng)下的我們?nèi)绾螒?yīng)用空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)凉蜂？
- 我們對(duì)空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)有著怎樣的期待？
前傳時(shí)代
廣義地說(shuō)性誉，同時(shí)獲得位置信息和轉(zhuǎn)錄組信息的技術(shù)都可以叫做空間轉(zhuǎn)錄組窿吩。可以看到错览，20世紀(jì)90年代后期纫雁，一些關(guān)于空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)的文章從激光捕獲顯微解剖(LCM)、微陣列或RNA-seq和單分子熒光原位雜交(smFISH)開(kāi)始了空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)的發(fā)展歷史倾哺。20世紀(jì)80年代的一些技術(shù)轧邪，雖然現(xiàn)在并不稱(chēng)為“空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)”，但它也是在空間中獲得轉(zhuǎn)錄信息羞海，因此在書(shū)中進(jìn)行了綜述忌愚，并將這部分稱(chēng)為“前傳”。因?yàn)樗钠鹪丛缬?laser-capture microdissection （LCM）微陣列却邓。其次硕糊，與現(xiàn)有的空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究所涵蓋的大多數(shù)技術(shù)不同，所使用的技術(shù)不是多路的腊徙，也不是定量的简十，因此在空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究中已經(jīng)不再受歡迎。相比之下昧穿，在“前傳”之后的的技術(shù)將被稱(chēng)為“當(dāng)前時(shí)代”勺远。更具體地說(shuō)，“前傳”是更廣泛的定義為方法时鸵，滿(mǎn)足更廣義的“空間轉(zhuǎn)錄組”定義，但不涉及芯片技術(shù)和下一代測(cè)序(NGS)或單分子成像技術(shù)厅瞎。
我們看到前傳時(shí)代的技術(shù)為我們刻畫(huà)了空間轉(zhuǎn)錄組的一般技術(shù)特點(diǎn)：成像饰潜，定位，表達(dá)量和簸。當(dāng)然我也看到前傳時(shí)代的空間轉(zhuǎn)錄一直在努力的一個(gè)方向是成像和單細(xì)胞（分辨率）彭雾，而表達(dá)量往往不是高通量獲得的。下面是前傳時(shí)代的技術(shù)特點(diǎn)锁保，研究物種的頻率薯酝，所形成的的空間數(shù)據(jù)庫(kù)半沽，數(shù)據(jù)分析方法，所用到的算法以及式微的可能原因：
很多當(dāng)時(shí)的技術(shù)已經(jīng)成了過(guò)眼云煙吴菠，加之當(dāng)時(shí)科學(xué)傳播（商業(yè)化）較低者填，很多技術(shù)還沒(méi)有走出其研發(fā)單位。所做的物種我們當(dāng)然是感興趣的做葵，我們看到以小鼠為主占哟，總的趨勢(shì)和現(xiàn)在的單細(xì)胞趨勢(shì)一致。數(shù)據(jù)庫(kù)這塊當(dāng)然是生物資源酿矢，現(xiàn)在有的數(shù)據(jù)庫(kù)還在維護(hù)著榨乎。值得關(guān)注的是數(shù)據(jù)分析這個(gè)模塊，我們看到當(dāng)時(shí)的技術(shù)條件下針對(duì)空間數(shù)據(jù)提出的生物學(xué)問(wèn)題對(duì)目前做空轉(zhuǎn)依然是有借鑒意義的瘫筐，可以說(shuō)雖然技術(shù)進(jìn)步了蜜暑，生物學(xué)問(wèn)題是相對(duì)保守的。算法層面我們也看到策肝，前傳時(shí)代也做了許多有益的嘗試史煎，甚至可以說(shuō)是為當(dāng)下時(shí)代提供了參考。而式微原因這一塊驳糯，作者也總結(jié)了篇梭，除了分辨率，易操作性酝枢，可用的軟件恬偷，豐富的文檔都是那時(shí)候所沒(méi)有的。關(guān)鍵是基于NGS的高通量表達(dá)量的獲取帘睦，在前傳時(shí)代中是沒(méi)有的袍患，所以適合做機(jī)理研究。至于前傳時(shí)代和當(dāng)下時(shí)代比較竣付，下文會(huì)有介紹诡延。
當(dāng)下時(shí)代
當(dāng)前時(shí)代延續(xù)了前傳時(shí)代的許多生物學(xué)問(wèn)題，如在空間上繪制轉(zhuǎn)錄組圖譜古胆，識(shí)別受限表達(dá)的基因肆良，對(duì)基因表達(dá)模式進(jìn)行分類(lèi)，為模型系統(tǒng)建立參考基因表達(dá)圖譜以及根據(jù)基因表達(dá)推斷解剖區(qū)域逸绎。雖然前傳時(shí)代也試圖識(shí)別細(xì)胞類(lèi)型標(biāo)記惹恃，但這已被非空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)取代，它已被用于識(shí)別標(biāo)記基因染色棺牧。雖然當(dāng)前的空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)在某種程度上借鑒了前傳時(shí)代的方法巫糙，但是一般為當(dāng)前空轉(zhuǎn)是對(duì)體微陣列或RNA-seq的改進(jìn)。如果非要有個(gè)節(jié)點(diǎn)的話(huà)颊乘，我們不妨把1999年出現(xiàn)的microarray 技術(shù)作為當(dāng)前高通量空轉(zhuǎn)的起點(diǎn)参淹。下圖是當(dāng)前時(shí)代主要的空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)發(fā)展時(shí)間線(xiàn)：
我們依然關(guān)心當(dāng)前時(shí)代的空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)發(fā)展特點(diǎn)醉锄，數(shù)據(jù)分析方法以及應(yīng)用場(chǎng)景。我們看到承接兩個(gè)時(shí)代的除了一些技術(shù)的運(yùn)用浙值，主要的還是如前所述生物學(xué)問(wèn)題恳不。空間轉(zhuǎn)錄組被Nature雜志評(píng)為2020年度技術(shù)亥鸠，而根據(jù)書(shū)中的統(tǒng)計(jì)2019年空轉(zhuǎn)技術(shù)有九種妆够，而2020年是十四種。如果說(shuō)單細(xì)胞技術(shù)是微流控的杰作负蚊，那么也可以說(shuō)微陣列給空轉(zhuǎn)帶來(lái)了第二次生命神妹。基于目前高通量技術(shù)的空轉(zhuǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)還很少家妆，可見(jiàn)空轉(zhuǎn)尚處于數(shù)據(jù)積累階段鸵荠，我們不敢預(yù)言它會(huì)像單細(xì)胞數(shù)據(jù)那樣呈指數(shù)增長(zhǎng)，但是在可見(jiàn)的未來(lái)里空轉(zhuǎn)數(shù)據(jù)一定是上升的伤极。與此同時(shí)蛹找，我們也看到得益于開(kāi)源生態(tài)的發(fā)展，特別是學(xué)術(shù)文章可以共享 code and data之后哨坪，每一篇文章都可以說(shuō)是一個(gè)小數(shù)據(jù)庫(kù)庸疾，而且code 為一般用戶(hù)提供了探索數(shù)據(jù)的可能。我們看到当编，2020年針對(duì)空轉(zhuǎn)已經(jīng)發(fā)表十幾種分析工具届慈，這業(yè)擴(kuò)展了科研人員的分析思路。
當(dāng)然忿偷，我們看到空轉(zhuǎn)在數(shù)據(jù)分析上與單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組是有相似的地方的：就基因表達(dá)譜這一塊金顿。有了空間信息之后，特別是在加入計(jì)算機(jī)鲤桥，圖像處理揍拆，空間統(tǒng)計(jì)知識(shí)之后，空轉(zhuǎn)所能提出和回答的問(wèn)題也多了起來(lái)茶凳，如導(dǎo)圖中羞澀的粉色背景所示的分析點(diǎn)嫂拴。值得一提的是，書(shū)中也對(duì)目前主流的空間轉(zhuǎn)錄組分析R包python庫(kù)等進(jìn)行了分類(lèi)和比較慧妄，這對(duì)我們數(shù)據(jù)分析過(guò)程中分析工具的選擇是有指導(dǎo)意義的顷牌。
兩個(gè)時(shí)代一個(gè)夢(mèng)想
探索高分辨率的空間轉(zhuǎn)錄組并不是什么新鮮事。早在上世紀(jì)80年代末和90年代塞淹，廣泛的多細(xì)胞生物基因組測(cè)序之前，它就已經(jīng)在增強(qiáng)器（enhancer ）和基因誘捕器（gene trap screens ）篩選中應(yīng)用了罪裹。然而饱普，前傳時(shí)代由于技術(shù)的挑戰(zhàn)使得對(duì)空間轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行分析的夢(mèng)想難以實(shí)現(xiàn)运挫，因?yàn)檫@些技術(shù)不是高度多元的，也不是精確定量的套耕。30多年后的今天谁帕，高分辨率空間組學(xué)的夢(mèng)想似乎越來(lái)越觸手可及了，雖然依然有一些需要注意的地方冯袍。
我們之所以能走到今天匈挖，是因?yàn)樽?010年以來(lái)各種各樣的想法和技術(shù)匯聚在一起。 如果沒(méi)有參考基因組序列康愤，高度多路復(fù)用smFISH不可能一次捕獲10000個(gè)基因儡循，沒(méi)有關(guān)于基因組和轉(zhuǎn)錄組的信息，探針的設(shè)計(jì)也不會(huì)如現(xiàn)在這般方便征冷。有一系列技術(shù)使得高通量空間轉(zhuǎn)錄組成為可能：smFISH择膝，共焦顯微鏡，數(shù)碼攝影检激，組合條形碼肴捉，以及較高的計(jì)算能力來(lái)存儲(chǔ)和處理圖像。如果沒(méi)有微陣列技術(shù)叔收、針對(duì)每個(gè)位點(diǎn)的少量RNA的scRNA-seq技術(shù)齿穗、NGS和處理數(shù)據(jù)的計(jì)算能力，ST和Visium就不可能實(shí)現(xiàn)饺律。這些組合里面有的技術(shù)出現(xiàn)較早窃页，有的出現(xiàn)較晚，沒(méi)有前傳時(shí)代的一些技術(shù)蓝晒，當(dāng)下的技術(shù)也不可能如此完善腮出。例如，如果沒(méi)有20世紀(jì)70年代末和80年代非放射性（non-radioactive ）FISH 的發(fā)展以及合成熒光團(tuán)標(biāo)記探針的技術(shù)芝薇，smFISH就不可能出現(xiàn)胚嘲。空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)領(lǐng)域自2010年代末以來(lái)發(fā)展迅猛洛二，正是這些技術(shù)鏈條匯聚在一起的合力馋劈。
空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)面臨的主要挑戰(zhàn)。
- 首先晾嘶，仍然存在數(shù)量和質(zhì)量之間的權(quán)衡妓雾。
ST和Visium的分辨率有限，檢測(cè)效率低垒迂，但更容易應(yīng)用于大面積的組織和全轉(zhuǎn)錄組械姻。ISS已經(jīng)被應(yīng)用于整個(gè)小鼠大腦切片，因?yàn)楸M管它的檢測(cè)效率低于smFISH机断，但放大的楷拳、不那么密集的信號(hào)可以在較低的放大率下檢測(cè)到绣夺。相比之下，基于smFISH的技術(shù)具有亞細(xì)胞分辨率欢揖，擁有超過(guò)80%的檢測(cè)效率陶耍，但當(dāng)應(yīng)用于10000個(gè)基因時(shí)效率會(huì)降低，而且更難應(yīng)用于更大的組織區(qū)域她混。由于仍然存在挑戰(zhàn)烈钞，收集數(shù)據(jù)的新技術(shù)也在不斷發(fā)展。
- 第二坤按，與前傳時(shí)代相比毯欣，當(dāng)下時(shí)代空轉(zhuǎn)技術(shù)更加精細(xì)化。
雖然商業(yè)化的LCM晋涣、ST和Visium已經(jīng)傳播得非常廣泛仪媒，但基于smFISH的各種高質(zhì)量技術(shù)大多未能走出研發(fā)實(shí)驗(yàn)室。這可能是由于構(gòu)建自定義細(xì)胞的困難以及針對(duì)不同組織定制統(tǒng)一操作規(guī)程的挑戰(zhàn)谢鹊，或有基因和細(xì)胞數(shù)量的限制算吩，也有部分是因?yàn)槿狈y(tǒng)一的、開(kāi)源的和文檔化的軟件平臺(tái)來(lái)處理數(shù)據(jù)佃扼。其實(shí)個(gè)性化和普適性本身就是一種矛盾偎巢。
算法與工具
從21世紀(jì)初的PCA和ICA到深度神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，空間數(shù)據(jù)分析取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步兼耀。許多起源于其他領(lǐng)域的想法压昼，如計(jì)算機(jī)視覺(jué)、機(jī)器學(xué)習(xí)和統(tǒng)計(jì)瘤运，包括地理空間統(tǒng)計(jì)窍霞，已經(jīng)被采用。來(lái)自計(jì)算機(jī)視覺(jué)的思想包括SIFT, NMF, CNN拯坟，以及某種程度上的PCA和ICA但金。機(jī)器學(xué)習(xí)的思想包括支持向量機(jī)、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)郁季、詞袋（bag of words）冷溃、變分自編碼器(用于某些潛在空間的情況)、混合專(zhuān)家模型梦裂、k最近鄰和聚類(lèi)似枕。來(lái)自統(tǒng)計(jì)的思想包括CCA、置換檢驗(yàn)年柠、MCMC凿歼、因子分析、廣義線(xiàn)性模型和層次建模。地理空間統(tǒng)計(jì)的思想包括高斯過(guò)程模型(通常用于kriging)毅往、空間點(diǎn)過(guò)程和MRF牵咙。其他觀(guān)點(diǎn)包括拉普拉斯積分和最優(yōu)傳輸（optimal transport）派近∨饰ǎ可以想象，空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)可以引入更多的觀(guān)點(diǎn)渴丸。例如侯嘀，時(shí)空統(tǒng)計(jì)可以用于分析同一組織的多個(gè)切片對(duì)齊，以解決z軸與x軸和y軸之間協(xié)方差的差異谱轨。地理空間統(tǒng)計(jì)中已有的方法戒幔，如半變異函數(shù)、J函數(shù)土童、G函數(shù)和其他點(diǎn)過(guò)程模型也可以引入诗茎。可見(jiàn)献汗，空間組學(xué)面向其他學(xué)科敢订，給出了廣泛的接口。這時(shí)候罢吃，我們可以說(shuō)自己的征途是星辰大海了楚午。
書(shū)中回顧了許多不同類(lèi)型的數(shù)據(jù)分析工具。然而尿招，像Seurat這樣的整合分析工具箱在空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)方面仍然不成熟矾柜，它只支持最基本的探索性數(shù)據(jù)分析。我們?nèi)匀恍枰獙W(xué)習(xí)不同的語(yǔ)言/工具就谜，并將數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為不同的格式怪蔑，以使用許多其他更專(zhuān)業(yè)和更高級(jí)的工具，而其中許多工具并沒(méi)有很好的文檔丧荐。
得益于開(kāi)源文化的蓬勃發(fā)展缆瓣。大多數(shù)當(dāng)前時(shí)代的數(shù)據(jù)分析出版物都有code and data，而大多數(shù)前傳時(shí)代發(fā)表的文章都沒(méi)有給出數(shù)據(jù)分析代碼的鏈接（當(dāng)時(shí)也沒(méi)有代碼池可以存放代碼）篮奄。雖然專(zhuān)有的MATLAB語(yǔ)言仍然在使用捆愁，但大多數(shù)當(dāng)前時(shí)代的文獻(xiàn)使用的是R, Python, c++，在某些情況下是Julia和Rust窟却，這些都是開(kāi)源和免費(fèi)的昼丑。開(kāi)源軟件和自由獲取的數(shù)據(jù)使得個(gè)人和機(jī)構(gòu)能夠低成本地執(zhí)行數(shù)據(jù)分析并開(kāi)發(fā)新的數(shù)據(jù)分析工具。以前重復(fù)一篇CNS的分析夸赫，需要看懂作者的思路微峰，現(xiàn)在只需要會(huì)配置代碼環(huán)境田盈。這也大大降低了學(xué)習(xí)門(mén)檻隘击，加速了技術(shù)普及和商業(yè)推廣缀程。
未來(lái)可期
空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)的理想未來(lái)是什么樣的？我們不妨來(lái)暢想一番：
數(shù)據(jù)采集將具有亞細(xì)胞分辨率曙砂，具有廣泛的轉(zhuǎn)錄組范圍，具有接近100%的檢測(cè)效率，并可在3D范圍內(nèi)擴(kuò)展到大面積組織辐董。更好的是，它是多組學(xué)的禀综，不僅分析轉(zhuǎn)錄組简烘，還分析表觀(guān)基因組、蛋白質(zhì)組定枷、代謝組等孤澎，與其他組學(xué)具有同樣高的質(zhì)量和通量。
此外欠窒，包括數(shù)據(jù)收集在內(nèi)的空間技術(shù)會(huì)很容易使用覆旭，比如使用方便、價(jià)格低廉的工具岖妄，因此它可以廣泛地傳播到非一般院校型将。它應(yīng)該也是開(kāi)源和透明的，這樣其他人就更容易改進(jìn)它衣吠。一如舊時(shí)王謝堂前燕茶敏，飛入尋常百姓家。每個(gè)分析點(diǎn)也會(huì)有基準(zhǔn)測(cè)試缚俏，而且方便用戶(hù)調(diào)節(jié)惊搏，就像dynverse 在scRNA-seq擬時(shí)間分析中的角色一樣。這將有利于普通用戶(hù)選擇工具以及開(kāi)發(fā)人員來(lái)比較他們的新方法忧换。
未來(lái)的空間數(shù)據(jù)分析是怎樣的呢恬惯？
數(shù)據(jù)分析對(duì)于不同的數(shù)據(jù)類(lèi)型有相同的用戶(hù)友好界面，對(duì)于相同的任務(wù)有不同的實(shí)現(xiàn)方法亚茬。此外酪耳，這個(gè)工具應(yīng)該是模塊化的，插件只有在需要時(shí)才安裝刹缝。它還應(yīng)該是可擴(kuò)展的碗暗，這樣用戶(hù)就可以為現(xiàn)有的任務(wù)添加額外的模塊或額外的工具到集成的本框架中。這與SeuratWrappers類(lèi)似梢夯，Seurat提供了數(shù)據(jù)集成和RNA velocity 方法的接口言疗，而這些方法不是由Seurat實(shí)現(xiàn)的∷淘遥或者像caret 和tidymodels噪奄，它們?yōu)樵S多機(jī)器學(xué)習(xí)方法提供了統(tǒng)一的用戶(hù)界面死姚。這可以通過(guò)諸如Bioconductor所使用的指導(dǎo)方針來(lái)實(shí)現(xiàn)，鼓勵(lì)開(kāi)發(fā)人員重用Bioconductor中現(xiàn)有的數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)和方法勤篮，而不是重復(fù)發(fā)明輪子都毒。
此外，分析工具還應(yīng)該是高效的碰缔、可擴(kuò)展的账劲、文檔良好的、開(kāi)源的手负、易于測(cè)試的涤垫、易于安裝的、可移植的竟终，同樣，在某種程度上Bioconductor指南也要求開(kāi)發(fā)者這樣做切蟋。它應(yīng)該用易于閱讀的代碼實(shí)現(xiàn)统捶，這樣開(kāi)發(fā)人員就可以更容易地修復(fù)bug和改進(jìn)。我們還期望柄粹，它是可互操作的喘鸟，這樣就可以集成用不同編程語(yǔ)言編寫(xiě)的工具，以結(jié)合它們的優(yōu)點(diǎn)驻右，并在編程語(yǔ)言社區(qū)之間架起文化差異的橋梁什黑。它應(yīng)該具有優(yōu)雅的數(shù)據(jù)可視化功能，并以交互式的形式用于數(shù)據(jù)探索和共享堪夭。數(shù)據(jù)可視化也應(yīng)該是可訪(fǎng)問(wèn)的愕把，例如使用冗余編碼和對(duì)色盲友好的調(diào)色板，并為那些視力受損的人提供替代方案森爽。最后恨豁，它應(yīng)該與圖形用戶(hù)界面(GUI)集成，如iSee爬迟，這樣分析結(jié)果就可以與不編程的同事共享橘蜜。
Museum of Spatial Transcriptomics一書(shū)中盛贊了開(kāi)源精神，本書(shū)也是免費(fèi)的付呕，地址見(jiàn)所附的第一條鏈接：
https://bookdown.org/lambdamoses/museumst/
https://github.com/lmweber/OSTA-base
https://github.com/drighelli/SpatialAnalysisWorkflows
Method of the Year: spatially resolved transcriptomics
機(jī)器學(xué)習(xí)中的Optimal Transport及相關(guān)問(wèn)題：（二）計(jì)算方法
Spatially Resolved Transcriptomes—Next Generation Tools for Tissue Exploration
Computational methods for single-cell omics across modalities
Profiling chromatin regulatory landscape: insights into the development of ChIP-seq and ATAC-seq
Spatial transcriptomics:paving the way for tissue-level systems biology
