scATAC分析神器ArchR初探-使用ArchR進行足跡（14）

14-使用ArchR進行足跡

轉(zhuǎn)錄因子（TF）足跡可以預(yù)測TF在特定位點的精確結(jié)合位置碰酝。這是因為實際上可以保護直接與TF結(jié)合的DNA堿基不易轉(zhuǎn)位，而可以接近與TF結(jié)合緊鄰的DNA堿基镊绪。

理想情況下璧榄，TF足跡在單個位置執(zhí)行言蛇，以確定TF的精確結(jié)合位置钝侠。但是檬嘀，實際上倒彰，這需要很高的測序深度秘症，通常比大多數(shù)用戶從批量或單細胞ATAC序列獲得的測序深度要高得多照卦。為了解決這個問題，我們可以在預(yù)計的TF綁定的許多實例中組合Tn5插入位置乡摹。例如役耕，我們可以獲取所有帶有CTCF基序的峰，并在整個基因組中為CTCF繪制總計的TF足跡聪廉。

該足跡的準確性取決于為感興趣的TF生成可靠的預(yù)測結(jié)合位點清單瞬痘。ArchR addMotifAnnotations()通過在峰區(qū)域中搜索與基序匹配的任何DNA序列，以一種幼稚的方式通過功能實現(xiàn)了此功能板熊。取決于目的基元的簡并性框全，這可能是足夠的，也可能不是足夠的干签。這些基元注釋ArchRProject以每個峰的二進制表示形式添加到中（0 =無基元津辩，1 =存在基元）。有了這些圖案注釋后容劳，ArchR將使用將getFootprints()一個ArchRProject對象和一個GenomicRanges包含圖案位置的對象作為輸入的功能執(zhí)行覆蓋喘沿。這些位置可以ArchRProject通過getPositions()功能從中訪問。然后可以使用plotFootprints() 功能竭贩。

也許最重要的是蚜印，ArchR中的足跡分析分析了已知的Tn5插入序列偏差。為此留量，ArchR在Tn5插入位點使用六聚體位置頻率矩陣和k-mer頻率矩陣：

綜上所述窄赋，該工作流生成的足跡圖考慮了Tn5插入偏差。

ArchR支持主題足跡和用戶提供的功能的自定義足跡楼熄，本章將對這兩者進行討論忆绰。

14.1主題足跡

重要的是，從本教程數(shù)據(jù)生成的足跡并不理想可岂，這是因為教程數(shù)據(jù)集的大小很小错敢。從較大的數(shù)據(jù)集生成的足跡將顯示出更少的變化。

進行覆蓋時青柄，我們要做的第一件事就是獲取相關(guān)圖案的位置伐债。為此，我們調(diào)用getPositions()函數(shù)致开。該函數(shù)有一個可選參數(shù)name峰锁，它可以接受peakAnnotation我們要從中獲取位置的對象的名稱。如果為name = NULL双戳，則ArchR將使用peakAnnotation插槽中的第一個條目虹蒋。在下面顯示的示例中，我們未指定name并且ArchR使用第一個條目即CIS-BP主題飒货。

motifPositions <- getPositions(projHeme5)

這將創(chuàng)建一個GRangesList對象魄衅，其中每個TF主題都由一個單獨的GRanges對象表示。

motifPositions

我們可以將其子集GRangesList化為我們感興趣的幾個TF主題塘辅。由于在搜索“ EBF1”時出現(xiàn)了SREBF1 TF晃虫，因此我們使用%ni%提供與%in%base 相對功能的輔助函數(shù)從下面的下游分析中明確刪除了它。R.

motifs <- c("GATA1", "CEBPA", "EBF1", "IRF4", "TBX21", "PAX5")
markerMotifs <- unlist(lapply(motifs, function(x) grep(x, names(motifPositions), value = TRUE)))
markerMotifs <- markerMotifs[markerMotifs %ni% "SREBF1_22"]
markerMotifs

為了準確地描繪TF足跡扣墩，需要進行大量讀取哲银。因此，將單元分組以創(chuàng)建偽批量ATAC-seq配置文件呻惕，然后將其用于TF足跡荆责。這些偽批量配置文件存儲為組覆蓋文件，我們最初在上一章中創(chuàng)建了這些文件以執(zhí)行高峰調(diào)用亚脆。如果您尚未將網(wǎng)上論壇報道添加到中ArchRProject做院，請立即進行。

projHeme5 <- addGroupCoverages(ArchRProj = projHeme5, groupBy = "Clusters2")

通過計算組覆蓋率濒持，我們現(xiàn)在可以計算先前使用該getFootprints()功能選擇的標記模體子集的足跡键耕。即使ArchR實現(xiàn)了高度優(yōu)化的足跡工作流程，還是建議對子集而不是所有主題執(zhí)行足跡弥喉。因此郁竟，我們通過positions參數(shù)將圖案的子集提供給足跡。

seFoot <- getFootprints(
  ArchRProj = projHeme5, 
  positions = motifPositions[markerMotifs], 
  groupBy = "Clusters2"
)

一旦檢索到這些足跡由境，就可以使用plotFootprints()函數(shù)將其繪制出來棚亩。此功能可以同時以各種方式對足跡進行歸一化。下一部分將討論足跡的標準化和實際繪制虏杰。

14.2 Tn5偏差的足跡歸一化

使用ATAC-seq數(shù)據(jù)進行TF足跡的一個主要挑戰(zhàn)是Tn5轉(zhuǎn)座酶的插入序列偏倚讥蟆，這可能導(dǎo)致TF足跡的錯誤分類。為了解決Tn5插入偏差纺阔，ArchR會識別每個Tn5插入位點周圍的k-mer（用戶定義的長度瘸彤，默認長度6）序列。為了進行此分析笛钝，ArchR會為每個假體識別單堿基分辨率Tn5插入位點质况，將這些1 bp位點的大小調(diào)整為k-bp窗口（插入后為-k / 2和+（k / 2-1）bp）愕宋，然后使用包中的oligonucleotidefrequency(w=k, simplify.as="collapse")函數(shù)創(chuàng)建一個k-mer頻率表Biostrings。然后结榄，ArchR使用與BSgenome相關(guān)的基因組文件中贝。為了計算偽大量足跡的插入偏差，ArchR創(chuàng)建了一個k-mer頻率矩陣臼朗，該矩陣表示為距圖案中心+/- N bp（用戶定義邻寿，默認為250 bp）的窗口上所有可能的k-mer。视哑。然后绣否，在每個主題位點上迭代，ArchR將定位的k-mers填充到k-mer頻率矩陣中挡毅。然后針對全基因組范圍內(nèi)的每個基序位置進行計算蒜撮。使用樣本的k-mer頻率表，ArchR可以通過將k-mer位置頻率表乘以觀察到/預(yù)期的Tn5 k-mer頻率來計算預(yù)期的Tn5插入慷嗜。

所有這些都發(fā)生在plotFootprints()功能內(nèi)部淀弹。

14.2.1減去Tn5偏置

一種歸一化方法是從覆蓋信號中減去Tn5偏置。通過normMethod = "Subtract"調(diào)用時的設(shè)置來執(zhí)行此規(guī)范化plotFootprints()庆械。

plotFootprints(
  seFoot = seFoot,
  ArchRProj = projHeme5, 
  normMethod = "Subtract",
  plotName = "Footprints-Subtract-Bias",
  addDOC = FALSE,
  smoothWindow = 5
)

默認情況下薇溃，這些圖將保存在outputDirectory中ArchRProject。如果您要求繪制所有圖案并將其作為ggplot對象返回缭乘，則該ggplot對象將非常大沐序。偏差減去分析后的圖案足跡示例如下所示。

14.2.2除以Tn5偏差

歸一化的第二種策略是將足跡信號除以Tn5偏置信號堕绩。通過normMethod = "Divide"調(diào)用時的設(shè)置來執(zhí)行此規(guī)范化plotFootprints()策幼。

plotFootprints(
  seFoot = seFoot,
  ArchRProj = projHeme5, 
  normMethod = "Divide",
  plotName = "Footprints-Divide-Bias",
  addDOC = FALSE,
  smoothWindow = 5
)

下面顯示了來自偏差劃分的分析的圖案足跡示例。

14.2.3 Tn5偏差未歸一化的封裝

雖然我們強烈推薦的Tn5序列插入偏置正火的腳印奴紧，就可以不進行歸通過設(shè)置執(zhí)行足跡normMethod = "None"的plotFootprints()功能特姐。

plotFootprints(
  seFoot = seFoot,
  ArchRProj = projHeme5, 
  normMethod = "None",
  plotName = "Footprints-No-Normalization",
  addDOC = FALSE,
  smoothWindow = 5
)

沒有歸一化的圖案足跡示例如下所示。

14.3功能足跡

除了覆蓋圖案之外黍氮，ArchR還可以覆蓋任何用戶定義的功能集唐含。為了說明這種功能，我們將使用該plotFootprints()功能來創(chuàng)建TSS插入配置文件（先前在數(shù)據(jù)質(zhì)量控制部分中介紹過）沫浆。TSS插入配置文件只是占位的特殊子情況捷枯。

如上一部分所述，使用從偽批量復(fù)制中導(dǎo)出的組覆蓋文件來執(zhí)行覆蓋专执。我們最初在上一章中創(chuàng)建了這些函數(shù)以執(zhí)行峰值調(diào)用淮捆。如果您尚未將網(wǎng)上論壇報道添加到中ArchRProject，請立即進行。

projHeme5 <- addGroupCoverages(ArchRProj = projHeme5, groupBy = "Clusters2")

我們創(chuàng)建的TSS插入配置文件沒有對Tn5偏差進行歸一化攀痊。與我們之前的分析的主要區(qū)別在于桐腌，我們指定flank = 2000在每個TSS的每一側(cè)將這些足跡擴展2000 bp。

seTSS <- getFootprints(
  ArchRProj = projHeme5, 
  positions = GRangesList(TSS = getTSS(projHeme5)), 
  groupBy = "Clusters2",
  flank = 2000
)

然后苟径，我們可以使用繪制每個細胞組的TSS插入圖plotFootprints()哩掺。

plotFootprints(
  seFoot = seTSS,
  ArchRProj = projHeme5, 
  normMethod = "None",
  plotName = "TSS-No-Normalization",
  addDOC = FALSE,
  flank = 2000,
  flankNorm = 100
)

參考材料：

https://www.archrproject.com/