Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas)9 系統(tǒng)成功被改造為第三代人工核酸內(nèi)切酶俺夕，與鋅指核酸內(nèi)切酶(zinc finger endonuclease歼争，ZFN)和類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶(transcription activator-likeeffector nuclease珠移，TALEN)一樣可用于各種復(fù)雜基因組的編輯韩脏。該技術(shù)成功應(yīng)用于人類細(xì)胞馏颂、斑馬魚和小鼠以及細(xì)菌的基因組精確修飾跨跨，修飾類型包括基因定點(diǎn)改造蔑舞、多位點(diǎn)同時(shí)改造等入偷。由于其突變效率高、制作簡單及成本低的特點(diǎn)眉枕，被認(rèn)為是一種具有廣闊應(yīng)用前景的基因組定點(diǎn)改造分子工具恶复。
對(duì)于CRISPR/Cas 的作用機(jī)理可以分為三個(gè)階段來理解，第一是CRISPR 的高度可變的間隔區(qū)的獲得速挑，第二是CRIPSR 基因座的表達(dá)(包括轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后的成熟加工)谤牡，第三是CRISPR/Cas 系統(tǒng)活性的發(fā)揮或者是對(duì)外源遺傳物質(zhì)的干擾。
CRISPR 的高度可變的間隔區(qū)(spacer)獲得姥宝，其實(shí)就是指外來入侵的噬菌體或是質(zhì)粒DNA 的一小段DNA 序列被整合到宿主菌的基因組翅萤，整合的位置位于CRRSPR 的5' 端的兩個(gè)重復(fù)序列之間(repeats)．因此，CRISPR 基因座中的間隔序列從5' 到3' 的排列也記錄了外源遺傳物質(zhì)入侵的時(shí)間順序．噬菌體或是質(zhì)粒上與間隔序列對(duì)應(yīng)的序列被稱為protospacer腊满，通常protospacer 的5' 或是3' 端延伸幾個(gè)堿基序列很保守套么， 被稱為PAM(protospacer adjacent motifs)培己，它的長度一般為2～5堿基，一般與protospacer 相隔1～4 堿基．新間隔序列的獲得可能分為三步：首先識(shí)別入侵的核酸和掃描外源DNA 潛在的PAM胚泌，將臨近PAM 的序列作為候選protospacer省咨；然后在CRISPR 基因座的5' 端合成重復(fù)序列；最后新的間隔序列整合到兩個(gè)重復(fù)序列之間．目前只有第一個(gè)步驟被證實(shí)诸迟，Cas1 和Cas2 蛋白是負(fù)責(zé)新間隔序列獲得的核心蛋白．另外研究發(fā)現(xiàn)TypeⅡ CRISRP/ Cas 系統(tǒng)中Csn2 蛋白對(duì)于新的間隔序列的獲得也是必需的茸炒。
CRISPR 基因座首先被轉(zhuǎn)錄成前體CRISPR RNA(pre-crRNA)，然后在Cas 蛋白或是核酸內(nèi)切酶的作用下被剪切成一些小的RNA 單元阵苇，這些小RNA 即為成熟crRNA壁公，由一個(gè)間隔序列和部分重復(fù)序列組成，TypeⅡ型CRISPR/Cas系統(tǒng)crRNA 的成熟除了需要Cas9 和RNaseⅢ參與以外绅项，還需要tracrRNA 的指導(dǎo)．CRISPR 基因座在沒有受到外界壓力的情況下表達(dá)水平很低．當(dāng)外源的質(zhì)廖刹幔或是噬菌體入侵宿主菌時(shí)CRISPR 的表達(dá)很快被誘導(dǎo)上調(diào)。
干擾是CRISPR/Cas 發(fā)揮抵御外源遺傳物質(zhì)入侵最關(guān)鍵的步驟快耿，成熟的crRNA 與特異的Cas 蛋白形成核糖核蛋白復(fù)合物囊陡，再與外源DNA 結(jié)合并掃描到外源DNA，尋找其上的靶序列掀亥，crRNA 的間隔序列與靶序列互補(bǔ)配對(duì)撞反，外源DNA 在配對(duì)的特定位置被核糖核蛋白復(fù)合物切割．早期研究認(rèn)為crRNA 的間隔序列(spacer)與外源DNA 的靶位點(diǎn)完全互補(bǔ)配對(duì)對(duì)于切割是必需的，但是后來的研究證明spacer 與protospacer 部分互補(bǔ)配對(duì)時(shí)切割也可以發(fā)生搪花。
