生信小課堂
影響因子：9.2
研究概述：
肝細胞癌（HCC）是全球癌癥相關(guān)死亡的第三大常見原因慧耍。大多數(shù)肝癌發(fā)展為肝纖維化或肝硬化身辨。基質(zhì)剛度是微環(huán)境中生物物理信號的特征蜂绎，異痴け恚基質(zhì)僵硬在腫瘤進展過程中起著重要作用笋鄙，是肝細胞癌發(fā)病率的強大預(yù)測因素师枣。作者研究了脂質(zhì)代謝重編程對基質(zhì)剛度引發(fā)的肝癌進展的具體影響。長鏈跸袈洌基-CoA脫氫酶（ACADL）是一種線粒體酶践美，可催化脂肪酸氧化的初始步驟洗贰，ACADL是一種重要的機械介質(zhì)，可以重新編程HCC細胞脂質(zhì)代謝陨倡。作者發(fā)現(xiàn)敛滋，ACADL依賴性機械反應(yīng)通路對不斷增加的基質(zhì)剛度（腫瘤微環(huán)境中的生物力學(xué)信號）做出反應(yīng)，并通過脂質(zhì)代謝重新編程促進HCC進展兴革，為HCC治療提供了新的治療目標绎晃。
本文屬于單腫瘤分型思路，類似的分型文章我們也解讀過很多杂曲。
腫瘤分型文章比較重要的結(jié)論就是分型后構(gòu)建的評分能夠預(yù)測免疫治療或者其他治療的療效庶艾。可以用于分型的基因集很多擎勘，比如焦亡咱揍，壞死性凋亡，鐵死亡棚饵，自噬煤裙，銅死亡硼砰，m7G欣硼，細胞衰老赂鲤，各類代謝等等廷粒。
另外還有基于單細胞的分型分析[最新8+單細胞測序結(jié)合bulk測序純生信。小編教你如何模仿并超越本篇文章踏拜。]
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研究結(jié)果：
BULK轉(zhuǎn)錄組分析揭示了HCC中明顯的代謝失調(diào)
作者估計了癌癥基因組圖集（TCGA）隊列中每個樣本中74個代謝途徑的豐富評分晚伙。根據(jù)74個代謝途徑的豐富評分，所有374個HCC腫瘤被歸類為三種異質(zhì)亞型漓帚，分成3組（圖1A-E）尝抖。
2.集群1特征是聚糖代謝途徑的相對上調(diào)牵署，與細胞外基質(zhì)（ECM）的產(chǎn)生有關(guān)奴迅，但三種主要營養(yǎng)素（碳水化合物取具、脂質(zhì)和氨基酸）的代謝途徑受到下調(diào)暇检。集群3特征是脂質(zhì)块仆、氨基酸和碳水化合物代謝途徑的顯著上調(diào)悔据。集群2的特征是每個主要類別的合并失調(diào)科汗。
3.腫瘤純度沒有顯著差異头滔。主成分分析（PCA）揭示了存在三個不同的轉(zhuǎn)錄組簇（圖1D）坤检，表現(xiàn)出不同的臨床特征早歇。此外蛀醉，集群1的總體生存率（OS）（p < 0.01）和無病生存率（DFS）明顯低于集群3（圖1F-G）衅码。第1組中wnt β-catenin信號傳導(dǎo)逝段、TGF-β信號傳導(dǎo)和PI3K/Akt mTOR信號顯著上調(diào)奶躯，這暗示各種與癌癥相關(guān)的通路被激活嘹黔。作者發(fā)現(xiàn)ECM受體相關(guān)途徑顯著富集儡蔓，在第1組中脂肪酸代謝途徑下調(diào)。脂肪酸代謝的下調(diào)與腫瘤的侵襲性相關(guān)旁振。
基于代謝途徑的集群表現(xiàn)出獨特的基因組和轉(zhuǎn)錄組學(xué)特征
以比較集群1和集群3樣本中的基因表達（圖2A）吉嚣。對每個差異表達的基因組進行了KEGG和REACTOME分析瓦戚，發(fā)現(xiàn)有絲分裂細胞周期檢查點较解、細胞周期階段和細胞外基質(zhì)組織的途徑在集群1中相對豐富印衔，與物質(zhì)代謝過程相關(guān)的基因集被發(fā)現(xiàn)在集群3中富集（圖2B）奸焙。在圓環(huán)圖中使用KEGG分析獲得了類似的結(jié)果与帆。與腫瘤發(fā)生和發(fā)育相關(guān)的類別在集群1中得到了豐富（圖2C）勿她，第3組中富集了與脂質(zhì)相關(guān)的代謝途徑（圖2D）阵翎。進一步分析表明砍聊，與第1組相比玻蝌，第3組脂肪酸和膽汁酸相關(guān)的代謝途徑明顯上調(diào)俯树，而第1組相比聘萨，第3組中包括“焦點粘附”米辐、“細胞粘附分子”、“ECM-受體相互作用”和“Hippo信號通路”的通路顯著上調(diào)（圖2E狸页，F(xiàn)）芍耘。
作者進一步分析了突變頻率最高的前20個基因（圖2G斋竞，H）坝初，發(fā)現(xiàn)CTNNB1绢要、TP53在集群1和集群3組中的突變頻率存在顯著差異拗小。
與癌癥相關(guān)成纖維細胞（CAF）和脂肪酸降解相關(guān)的途徑之間的相關(guān)性
1.通路分析表明蛆封，這些代謝途徑富含氨基酸和脂質(zhì)代謝，特別是脂肪酸降解围俘，也稱為“脂肪酸氧化（FAO）”（hsa00071）（圖3A）。分析脂肪酸降解途徑中所有基因的表達水平漾抬，發(fā)現(xiàn)這些基因在集群3中富集纳令，與其他亞群相比圈匆，大多數(shù)基因在集群3中表現(xiàn)出明顯更高的mRNA水平（圖3B）跃赚。生存分析顯示性湿，與低評分的患者相比纬傲，F(xiàn)AO通路得分較高的患者具有更好的DFS和OS（圖3C、D）肤频，表明FAO通路激活可能會抑制HCC的發(fā)生和發(fā)育叹括。
2.作者研究了微環(huán)境中不同細胞亞群的轉(zhuǎn)錄模式，并發(fā)現(xiàn)集群1和集群3之間存在顯著差異着裹。（圖3E-F）與第3組的患者相比领猾，第1組T細胞譜系米同、細胞毒性淋巴細胞、NK細胞摔竿、B細胞熬苍、單核細胞柄驻、巨噬細胞野哭、骨髓細胞和癌癥相關(guān)成纖維細胞（CAF）的豐度顯著較高，特別是CAF态兴。同樣，第1組的患者表達了高水平的CAF標志物（圖3G）。此外，CAF評分的程度與FAO評分呈負相關(guān)（圖3H）。FAO與成纖維細胞遷移帕识、膠原蛋白激活信號通路帽借、膠原蛋白形成巍举、膠原蛋白受體活性和膠原蛋白生物合成過程表現(xiàn)出顯著的負相關(guān)性（圖3H）炭分。脂肪酸降解的生物過程可能與CAF的功能有關(guān)。
基于scRNA-seq數(shù)據(jù)的腫瘤微環(huán)境中惡性細胞和其他細胞的代謝途徑亞型
作者使用肝癌單細胞數(shù)據(jù)，鑒定出七種主要細胞類型，包括T細胞撇吞、惡性細胞煮岁、未分類細胞响禽、腫瘤相關(guān)巨噬細胞（TAMs）、B細胞、腫瘤相關(guān)內(nèi)皮細胞（TECs）和CAFs（圖4A）重付。分析顯示导街，惡性細胞和TAM以及CAF之間受體-配體對的相互作用明顯增加幔妨，這表明這兩個集群之間的細胞通信密切误堡。
可視化單個細胞的代謝多樣性，發(fā)現(xiàn)脂肪酸降解途徑主要在惡性細胞中富集，而ECM蛋白聚糖途徑在CAF中富集（圖4B媳否、C）吕喘。
根據(jù)相同的聚類方法觅彰，所有患者都被穩(wěn)定地分配到三種代謝亞型（圖4D性置，E）拾并，第3組的脂肪酸降解評分明顯上調(diào)，而第1組的O-聚糖代謝上調(diào)鹏浅。每種細胞類型的比例因集群而異（圖4D）嗅义。進一步分析表明，與第1組相比隐砸，第3組的脂肪酸降解評分顯著上調(diào)之碗。膠原蛋白相關(guān)途徑在CAF和集群1中顯著豐富，集群3中惡性細胞和脂質(zhì)代謝途徑顯著豐富（圖4F季希，G）褪那。上述途徑水平在CAF和惡性細胞之間顯示出很強的負相關(guān)性（圖4H）.
ACADL作為脂肪代謝的關(guān)鍵酶在HCC中受到下調(diào)
作者總結(jié)了在集群3中高度表達的十大途徑的關(guān)鍵酶（表1）。單變量Cox回歸分析顯示式塌，只有FAO相關(guān)基因（ACADL）保持顯著的預(yù)后意義（圖5A）博敬。ACADL是FAO線粒體第一步的關(guān)鍵酶，與正常肝臟相比峰尝，在肝癌組織中中減少（圖5B）偏窝。ACADL與各種CAF和膠原蛋白相關(guān)基因呈負相關(guān)（圖5C），各種腫瘤的ACADL顯著降低（圖5D）。與ACADL表達率高的HCC患者相比囚枪，ACADL表達率低的HCC患者的總體生存率和無疾病生存率較低（圖5E派诬、F）。
進一步分析表明链沼，在較高的HCC臨床階段默赂，ACADL表達逐漸下降。HCC患者被分為兩組括勺，肝基質(zhì)較硬的患者ACADL表達較低（圖5G）缆八。在外部驗證隊列中觀察到類似的結(jié)果（圖5H-J）。作者猜想疾捍，基質(zhì)硬度可能會通過調(diào)節(jié)ACADL表達來影響脂質(zhì)代謝的重新編程奈辰。
基質(zhì)剛度通過YAP-TEAD4-ACADL調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝重新編程
1.為了驗證假設(shè)，使用HepG2乱豆、Huh7和SK-Hep1 HCC細胞進行測試奖恰，微剛度分別為2 kPa和16 kPa。HCC細胞在16 kPa的支撐上呈現(xiàn)侵入性表型宛裕，顯示具有典型HCC細胞形態(tài)的多邊形細胞的突出外觀瑟啃，而2 kPa以下細胞是球形的，以小點出現(xiàn)（圖6A）揩尸。16 kPa高基質(zhì)剛度的肝癌細胞增加了介質(zhì)中的游離脂肪酸水平蛹屿，mRNA和ACADL的蛋白質(zhì)水平明顯下調(diào)（圖6B-D）。在高剛度基質(zhì)中觀察到活性YAP/TAZ的上調(diào)蛋白水平（圖6D）岩榆。
2.Verteporfin是一種YAP抑制劑错负，可以破壞YAP-TEAD的相互作用。當用增加的Verteporfin濃度進行治療時勇边，HCC細胞表現(xiàn)出明顯較低的脂質(zhì)積累水平犹撒，這表明破壞YAP-TEAD相互作用可以幫助利用HCC中的脂質(zhì)（圖6E）。隨著verteporfin濃度的增加粥诫，HCC細胞中的ACADL mRNA和蛋白質(zhì)水平增加（圖6F油航，G）。此外怀浆，YAP下游基因CYR61在Verteporfin治療濃度的增加下逐漸降低（圖6H）。ACADL的mRNA和蛋白質(zhì)水平在YAP5SA過度表達HepG2和Huh7細胞中都出現(xiàn)下調(diào)（圖6I怕享，J）执赡。細胞質(zhì)/核蛋白提取分析表明，YAP在軟支撐上的細胞中的核積累較少（圖6K）函筋。這些結(jié)果表明沙合，ACADL表達在轉(zhuǎn)錄水平上受到Y(jié)AP的負面調(diào)節(jié)。
3.作者識別了人類ACADL基因啟動子區(qū)域的三個保守的TEAD4結(jié)合位點（AGCATTCTTT）（圖6L）跌帐。染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）PCR結(jié)果表明首懈，TEAD4可能會與ACADL啟動子遠端保守位點（R3）結(jié)合（圖6M）绊率。作者生成了兩個由野生型（WT）和TEAD4結(jié)合缺陷ACADL啟動子驅(qū)動的熒光素酶記錄器（圖6K）。siRNA介導(dǎo)的YAP/TAZ擊倒顯著增強了HepG2和Huh7細胞中WT ACADL啟動子R3的轉(zhuǎn)錄活性究履，但對突變ACADL啟動子沒有影響（圖6N）滤否。
軟基質(zhì)增加體內(nèi)ACADL的mRNA和蛋白水平
動物實驗流程如圖7A所示。β-氨基丙烯腈（BAPN）是一種LOX活性抑制劑最仑。和對照組相比藐俺，BAPN組的腫瘤體積明顯較小，較輕（圖7B-D）泥彤，膠原蛋白含量顯著下降（圖7E）欲芹，ACADL腫瘤組織中的mRNA和蛋白質(zhì)水平變高，ACADL的表達顯著增加吟吝，CAF標記基因YAP和α-SMA的表達顯著增加（圖7F）菱父。
膠原蛋白含量的增加和ACADL下調(diào)協(xié)同預(yù)測了肝癌患者的不良預(yù)后
免疫熒光表明，I型膠原蛋白染色特異性地存在于腫瘤的基質(zhì)中剑逃，而ACADL優(yōu)先分布在細胞質(zhì)中浙宜，膠原蛋白含量與HCC中的ACADL表達水平呈顯著負相關(guān)（圖8A，B）炕贵。與順應(yīng)性腫瘤患者相比梆奈，硬性腫瘤患者的OS較差（圖8C）。低ACADL表達的患者比高ACADL表達的患者預(yù)后更差（圖8D）称开。
HCC患者預(yù)后根據(jù)ACADL表達水平和膠原蛋白含量分層亩钟，膠原蛋白低/ACADL高腫瘤患者相比，高膠原蛋白/ACADLlow腫瘤患者的生存結(jié)果明顯較差（圖8E）鳖轰。在TCGA-LIHC隊列中清酥，高膠原蛋白/ACADLlow的腫瘤與生存率低下有關(guān)（圖8F）。本研究表明ACADL依賴性機械反應(yīng)通路是HCC治療的潛在治療目標（圖8G）
研究總結(jié)：本研究中蕴侣，作者證明焰轻，肝癌患者根據(jù)其代謝特征具有獨特的轉(zhuǎn)錄組特征，這表明針對代謝脆弱性的不同治療策略可能對肝癌患者的亞群具有臨床優(yōu)勢昆雀。此外辱志，這項研究還將基質(zhì)剛度-ACADL軸與脂質(zhì)代謝重編程和HCC進展聯(lián)系起來，表明ACADL依賴性機械反應(yīng)通路是HCC治療的潛在治療目標狞膘。
