●英文題目：《Ancient Hybridization with an Unknown Population Facilitated High-Altitude Adaptation of Canids》
●期刊：MOL BIOL EVOL
●影響因子：2022_IF=8.8鲫忍；中科大類: 生物學(xué)1區(qū); 中科小類: 生化與分子生物學(xué)倚舀，進(jìn)化生物學(xué)砸民，遺傳學(xué)1區(qū); JCR分區(qū): Q1
●發(fā)文單位：中國科學(xué)院昆明動物所、加利福尼亞大學(xué)圣戈魯茲分星妈荆霍華德●休斯醫(yī)學(xué)研究所志电，云南大學(xué)彻消、中國農(nóng)業(yè)大學(xué)等等多個機(jī)構(gòu)
●文章作者：中國科學(xué)院昆明動物所、加利福尼亞大學(xué)圣戈魯茲分邢福霍華德●休斯醫(yī)學(xué)研究所王明山笨触、中國科學(xué)院昆明動物所王勝、云南大學(xué)李巖雹舀、等為共同第一作者芦劣；中國科學(xué)院昆明動物所張亞平院士、吳冬冬研究員等说榆，為文章共同通訊作者
●摘要：遺傳漸滲不僅為適應(yīng)性進(jìn)化提供了物質(zhì)基礎(chǔ)虚吟，也給我們對進(jìn)化史的理解帶來了困惑。 犬科動物尤其如此签财，它是一個復(fù)雜的物種稍味，基因組測序和分析揭示了其混合和漸滲的復(fù)雜歷史。 在這里荠卷，我們對來自高海拔地區(qū)的西藏和喜馬拉雅狼和狗的19個新的全基因組進(jìn)行了測序模庐，并將它們組合成一個由166個全犬基因組組成的更大的數(shù)據(jù)集。 利用這些數(shù)據(jù)油宜，我們探索了這些和其他犬科動物的進(jìn)化史和適應(yīng)性掂碱。 我們發(fā)現(xiàn)，西藏狼和喜馬拉雅狼的親緣關(guān)系密切慎冤，它們~39%的核基因組來自一個尚未被識別的類狼血統(tǒng)疼燥，與現(xiàn)存的泛北極區(qū)狼和狗有著很大的分歧。 EPAS1 單倍型在西藏犬種和狼中的頻率很高蚁堤，對生活在高海拔地區(qū)的動物具有適應(yīng)性優(yōu)勢醉者，可能來自這一古老的譜系。 我們的研究強(qiáng)調(diào)了犬科動物進(jìn)化的復(fù)雜性，并展示了混合和漸滲如何塑造物種的進(jìn)化軌跡撬即。
●前言：隨著高通量測序的發(fā)展和比較群體基因組學(xué)的進(jìn)步立磁，不同譜系之間的基因流在物種進(jìn)化中扮演著越來越重要的角色。 在一些情況下剥槐，在過去混合后的基因流動事件允許已經(jīng)滅絕的譜系的遺傳片段持續(xù)存在唱歧。 例如，在解剖學(xué)上的現(xiàn)代人離開非洲后粒竖，與古人類混合導(dǎo)致了來自古人類譜系的等位基因的滲入颅崩，今天在一些人類群體中觀察到這種滲入頻率很高，這表明這些等位基因提供了適應(yīng)性優(yōu)勢蕊苗。 這方面的一個典型例子是丹尼索瓦人衍生的 EPAS1 等位基因在當(dāng)代西藏人中的高頻率沿后，這導(dǎo)致西藏人的低氧反應(yīng)減弱，并允許適應(yīng)青藏高原低氧環(huán)境的生活朽砰。
混合和基因組漸滲在犬科中尤其普遍得运，包括狗、狼锅移、郊狼熔掺、豺狼、野狗和許多其他現(xiàn)存以及滅絕的犬科類動物非剃。 由此產(chǎn)生的犬類的網(wǎng)狀進(jìn)化史使解開它們的進(jìn)化關(guān)系和確定狗馴化的時間和地點(diǎn)變得復(fù)雜置逻。 青藏高原(QTP)的高海拔狼（HAWs）是最神秘的犬科動物譜系之一，其起源和進(jìn)化關(guān)系仍懸而未決备绽。 這些HAWs通常分為兩組券坞，西藏灰狼(TW)和喜馬拉雅狼(HW)。 HWs分布在尼泊爾的Transhimalayan地區(qū)肺素、印度北部克什米爾東部拉達(dá)克地區(qū)恨锚、喜馬偕爾邦和鄰近地區(qū)，而TWs分布在甘肅倍靡、青海和西藏等省猴伶。 這兩只狼的數(shù)量都非常少，非常脆弱塌西，目前在印度和尼泊爾他挎，狼受到野生動物立法的保護(hù)。
盡管通過形態(tài)學(xué)和遺傳學(xué)研究可以更好地理解它們的進(jìn)化史捡需，但HAWs的起源以及它們與其他灰狼的關(guān)系仍然不清楚办桨。 早期的形態(tài)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)HAWs有別于歐亞狼，并認(rèn)為它們是一個獨(dú)特的亞種站辉。 線粒體DNA分析發(fā)現(xiàn)呢撞，HW與TW聚在一支簇损姜，與其他灰狼有顯著不同，并建議這些HAWs可以作為一個單獨(dú)的物種殊霞。 然而摧阅，對整個核基因組的分析發(fā)現(xiàn)，TW與來自中國北方的灰狼聚集在一個與歐洲狼是姐妹的分支脓鹃。 這項研究表明TW起源于亞洲狼的一個譜系，并在大約2.5萬年前(KA)與中國北方狼分離后重新定居QTP古沥。 最近瘸右，對核基因組的另一項分析表明，TW的系統(tǒng)發(fā)育位置取決于用于估計一致系統(tǒng)發(fā)育的方法岩齿。 具體地說太颤，使用NJ法估計的一棵樹將TW作為中國北方狼的姐妹群，與之前的分析一樣盹沈，而使用最大似然估計的系統(tǒng)發(fā)育將TW作為狗和所有歐洲和亞洲狼的基礎(chǔ)龄章。 由于HW的核基因組尚未測序，基于核基因組的TW和HW之間的親緣關(guān)系尚不清楚乞封。
TW和HWS都在基因上適應(yīng)了高海拔的惡劣生活條件做裙。 一個基因，EPAS1肃晚，是一個誘導(dǎo)對缺氧的物理反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子锚贱，估計是在強(qiáng)正選擇下在藏狗（TDs）和TW中進(jìn)化出來的。 已知TW和HW都攜帶一種獨(dú)特的 EPAS1 單倍型关串，這種單倍型被認(rèn)為是在正選擇下進(jìn)化而來的拧廊，但適應(yīng)性 EPAS1 等位基因的起源仍然未知。 以前的研究認(rèn)為晋修，EPAS1 是在狗被引入QTP后從TW流向TD的吧碾，可能是在舊石器時代人類在該地區(qū)定居后。 這一假設(shè)是基于TW和亞洲狼之間的姐妹關(guān)系墓卦，以及TW在引入狗之前就已經(jīng)棲息在QTP的假設(shè)倦春。 然而，這些進(jìn)化關(guān)系仍未解決落剪，替代假設(shè)也是可能的溅漾。 例如，高海拔的 EPAS1 等位基因可能在狗體內(nèi)進(jìn)化著榴，后來又流向狼體內(nèi)添履。 從狗到狼的滲入是眾所周知的； 例如脑又，Klocus（一種犬類β-防御素基因）中的一個三堿基對(BP)突變導(dǎo)致黑色毛色并賦予更高的適應(yīng)性暮胧，通過雜交從狗傳播到美國灰狼锐借。 由于QTP的兩種HAWs、其他狼和狗之間的進(jìn)化關(guān)系仍然不清楚往衷，適應(yīng)性 EPAS1 等位基因的起源也不清楚钞翔。
在這里，我們對HW席舍、TW和狗的完整核基因組進(jìn)行了測序布轿，并與已發(fā)表的中國狼、狗和其他犬科動物的基因組進(jìn)行了分析来颤。通過明確考慮HAWs和其他犬科動物的混合關(guān)系汰扭，我們發(fā)現(xiàn)TW和 HW與歐亞灰狼、家犬和一個現(xiàn)已滅絕或未知的類狼犬科動物的混合關(guān)系密切福铅。 然后我們特別探索 EPAS1 等位基因的進(jìn)化起源萝毛，我們發(fā)現(xiàn)這些生活在QTP上的譜系共享 EPAS1 等位基因，可能來自以前未描述的深度分歧的犬科譜系滑黔。
●結(jié)果：
1笆包、基因組測序和進(jìn)化關(guān)系
我們對19個狼和狗的全基因組進(jìn)行了測序，平均覆蓋度為8.5倍略荡。 這包括兩只TW庵佣，其中一只來自西藏林芝，另一只來自中國青海汛兜，一只HW來自印度長塘拉達(dá)克秧了，以及16只來自QTP的狗(>2000米）。 利用這些和以前發(fā)表的狼和狗的基因組數(shù)據(jù)序无，我們編制了一個166個完整基因組的數(shù)據(jù)集验毡，包括9個TW、1個HW帝嗡、34個TD晶通、11個低地狼（LWs；1個克羅地亞狼哟玷、1個以色列狼狮辽、3個俄羅斯狼、5個蒙古狼和1個中國狼）巢寡、109個低地狗(LDs)喉脖、1個金豺和1個Dhole。 我們將這些數(shù)據(jù)比對到狗的參考基因組(CANFAM3.1)上抑月，并鑒定了超過2640萬個SNPs树叽。
接下來入挣，我們使用F4-statistics對青藏高原狼與狗之間的混合進(jìn)行了測試。 F4-以F4（outgroup硝拧，HAW径筏；LW，狗）障陶，發(fā)現(xiàn)HAW與LW的等位基因共享比與狗的多(F4<0）滋恬； 以F4（outgroup, HAW；TD和LD）的形式揭示了HAW和高原犬之間基因流動的證據(jù)(F4<0）抱究。 在F4（outgroup恢氯，狗厘擂；LW特愿，HAW）中，高原和低海拔的狗與LW比與HAW共享更多祖先(F4<0）贡耽。 如果HAW像以前報道的那樣與北亞狼聚類侄刽，并與TD有基因流動指黎，則后一發(fā)現(xiàn)是意想不到的朋凉。 這類似于丹尼索瓦人和尼安德特人基因組研究中觀察到的模式州丹，并提醒我們思考一種情況：HAW可能有混合祖先，衍生出一個更嚴(yán)重分歧的譜系杂彭。 對這一假說的進(jìn)一步支持來自對FST的估計墓毒，該估計表明HAW與狗的遺傳差異幾乎是LW的兩倍（圖2a）。 然而亲怠，這些模式也有可能是LW和狗之間反復(fù)發(fā)生基因流動的結(jié)果所计。 為了進(jìn)一步探索這一點(diǎn)，我們使用qpGraph構(gòu)建混合圖团秽，并屏蔽狗和狼種群之間的差異和基因流主胧。 HAW（沒有F4異常值）可以被模擬為一個混合群體，最初是由一個分化譜系（39%）和LW（61%）之間的混合產(chǎn)生的习勤，然后這個群體（混合）后來由一個與TD（圖2B)有關(guān)的譜系產(chǎn)生了18%的祖先踪栋。 這與基于全基因組遺傳片段的三大拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)大體一致。然而图毕，假設(shè)HAW和LW是姐妹分支并允許LW和Dog之間的基因流動的混合圖產(chǎn)生了過量的F4異常值夷都，表明擬合不良。 鑒于LDs和歐亞狼之間的差異和種群亞結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性予颤，我們進(jìn)行了一系列額外的分析囤官，在這些分析中冬阳，我們識別了包括EUW、CHW党饮、華南犬肝陪、非洲和歐洲犬在內(nèi)的離散類群，并以多個組合對這些類群進(jìn)行了qpGraph刑顺，以檢驗這些類群內(nèi)異質(zhì)性的影響见坑。 盡管這些類群和HAW之間的基因流量略有變化，取決于LD和LW類群的組合所包含的種群捏检，但基于模型的混合圖荞驴，HAW攜帶分歧的遺傳輸入，沒有F4異常值贯城，表明相當(dāng)好的模型擬合熊楼。
上面描述的分析支持了 HAW 有一定數(shù)量的祖先來自不同的犬科動物血統(tǒng)的假設(shè)。 為了進(jìn)一步探索這一點(diǎn)能犯，我們使用隱馬爾可夫模型(HMM)方法尋找 HAW 中具有“發(fā)散”起源特征的基因組區(qū)域鲫骗。 該方法通過將給定個體的基因組序列與未混合的參考群體進(jìn)行比較，來尋找包含出人意料的高密度特異突變的基因組短區(qū)域踩晶。 我們選擇 LD 和 LW 作為假定的未混合參考群體执泰，并衡量沿著每條染色體在1-kb窗口內(nèi)的突變密度。 由于犬和狼種群之間的差異渡蜻、亞結(jié)構(gòu)和混合性术吝，LD和LW可能不是完美的非混合種群。 然而茸苇，以前對LD和LW 與 HAW 混合研究會導(dǎo)致對HAW發(fā)散量的低估排苍。 假設(shè)作者（Skov et al.2018)建議的后驗概率為0.8，我們在 HAW 基因組中發(fā)現(xiàn)了幾個推定高度分歧的區(qū)域学密。 這些結(jié)果表明 HAW 含有狼血統(tǒng)的混合血統(tǒng)淘衙，比LD和LW分化更加深刻。為了進(jìn)一步探索這些高度分歧的基因組區(qū)域的進(jìn)化史腻暮，我們創(chuàng)建了一個僅限于這些基因組區(qū)域的比對彤守，包括北美狼、郊狼哭靖、dhole 和非洲野狗具垫，并構(gòu)建了一個NJ樹。 由此產(chǎn)生的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系表明款青，兩只北美狼是狗和歐亞狼是基礎(chǔ)譜系做修，HAW 是所有極地狼和狗是基礎(chǔ)譜系（圖2c)，類似于線粒體系統(tǒng)發(fā)育（圖1C）。 同樣的結(jié)果得到了使用更嚴(yán)格的0.9后驗概率截斷恢復(fù)的發(fā)散片段中推斷出來的NJ樹的支持饰及，（圖S9b）蔗坯。 總的來說，這些分析表明燎含，在QTP上的現(xiàn)代狼的基因組包含一部分與LW共有的祖先宾濒，一部分與家犬共有的祖先，以及至少與另一個尚未描述的擁有更深的分化的血統(tǒng)共有的祖先屏箍。
2绘梦、群體演化歷史
為了進(jìn)一步探索高原狼和 LWs 之間的差異，我們接下來使用兩兩順馬爾可夫聚類(PSMC)和多重順馬爾可夫聚類(MSMC)估計了這些譜系成員的進(jìn)化軌跡赴魁。 以前的一項核基因組分析報告稱卸奉，TW 和 North Chinese wolves 在狗的多樣性之外形成了一個單系分支。 如果這種關(guān)系是正確的颖御，我們會期望 TW 與這些 LW 有一個類似的進(jìn)化軌跡榄棵。 然而，我們發(fā)現(xiàn) TW 和 LW 的進(jìn)化軌跡在100 ka左右發(fā)生了分歧潘拱，此時TW種群規(guī)模開始下降疹鳄，而LW直到后來才下降（圖3a)。
為了估計狗和狼之間的分歧時間芦岂，我們利用 MSMC 對相對交叉融合率(CCR)的估計瘪弓，并使用50%的CCR作為分歧時間的經(jīng)驗法則。 我們發(fā)現(xiàn)狗譜系與 LW 譜系分歧發(fā)生在52.5ka（圖3b)禽最。 如果 TW 和 LW 是沒有差異滲入或混合的單系分支腺怯，我們期望TW和狗的分歧與LW和狗相似。 然而弛随，我們發(fā)現(xiàn)TW與LW和狗的分化分別發(fā)生在 68和81 ka（圖3b)瓢喉。
3宁赤、模擬分析
以前舀透，PSMC 觀察到的 TW 和歐亞狼之間的分化模式被認(rèn)為是由于在最近 TW 種群規(guī)模發(fā)生下降。 為了測試我們的結(jié)果是否是TW最近種群數(shù)量下降的結(jié)果决左，我們接下來進(jìn)行了一系列模擬愕够，假設(shè)兩個不同規(guī)模的種群分開在30 ka左右（以反映狗和狼之間通常假設(shè)的分歧時間），在此之后佛猛，群體會經(jīng)歷不同嚴(yán)重程度的瓶頸（圖S12）惑芭。 然后，我們用 PSMC 和 MSMC 估計了這些模擬種群的進(jìn)化軌跡和發(fā)散時間继找，并將結(jié)果與真實數(shù)據(jù)（圖S13）進(jìn)行了比較遂跟。 這些情況都沒有產(chǎn)生真實數(shù)據(jù)中描述的較早的分歧時間（圖3)，這表明 TW 種群的下降并不能解釋其分歧的進(jìn)化軌跡。
對于 TW 和狗之間的分歧時間比 LW 和狗之間的分歧時間更早的估計幻锁，另一個潛在的解釋是 TW 基因組包含一些來自更古老譜系的祖先成分凯亮。 為了驗證這一假設(shè)，我們進(jìn)行了額外的模擬哄尔，兩個群體的分化為30 ka左右假消，其中一個群體接受了來自更深分化群體的不同水平的基因流（我們假設(shè)他們的差異為90 ka；圖S12）岭接。 我們發(fā)現(xiàn)富拗，來自分化群體的基因流影響了 PSMC 和 MSMC 的估計進(jìn)化軌跡的符合數(shù)量（圖S13），反映了在TW（圖 3）觀察到的模式鸣戴。 這一分析支持了這樣一個假設(shè)啃沪，即 HAW 基因組有一定比例的祖先來自分歧更深的狼譜系。
4窄锅、HAW和狗群體的混合
接下來谅阿，我們使用相對同系（rIBD）和基因座特異性分支長度（LSBL）統(tǒng)計量尋找適應(yīng)性漸滲的證據(jù)。我們鑒定出了在TD和HAW之間表現(xiàn)出最強(qiáng)適應(yīng)性漸滲信號的三個基因：EPAS1酬滤、PRKCE和TMEM 247签餐。這三種基因都出現(xiàn)在10號染色體的同一個區(qū)域。特別是盯串，與鄰近區(qū)域相比氯檐，含有 EPAS1 的區(qū)域顯示出最顯著的漸滲特征（由“ABBA/BABA”、fd統(tǒng)計和RFMix支持）以及TD/HAW和LD/LW之間最顯著的群體分化（FST）体捏」谏悖總之，這些結(jié)果表明選擇可能發(fā)生在這個基因上几缭。
5河泳、現(xiàn)代HAW和狗中 EPAS1 基因來自一個古老的譜系
由于HAW是青藏高原特有的，先前的分析表明年栓，家犬引入高原后拆挥，適應(yīng)性 EPAS1 等位基因的漸滲方向是從 HAW 到 TD。然而某抓，我們觀察到TD中適應(yīng)性等位基因的頻率更高（60/68;88.2%）高于HW和TW（75%;[2 + 13]/[2 + 18]）（圖4A）纸兔。
我們接下來通過將跨越 EPAS1 和跨越染色體10的相鄰區(qū)域的序列劃分為100、250否副、500和1汉矿，000 kb的長度來構(gòu)建樹。我們發(fā)現(xiàn)备禀，包括 EPAS1 在內(nèi)的整個區(qū)域的系統(tǒng)發(fā)育具有一種拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)洲拇，其中TD和HAW是 LW 和其他犬的基礎(chǔ)譜系（圖S18）奈揍。這與 EPAS1 區(qū)域周圍區(qū)域的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)相反，其中HAW是所有狗和LW的基礎(chǔ)譜系赋续。此外打月，我們通過整合來自郊狼、非洲野狗蚕捉、和北美狼的基因組構(gòu)建了 EPAS1 及其側(cè)翼區(qū)域的單倍型樹奏篙。NJ樹顯示，HW迫淹、TW和TD攜帶的適應(yīng)性 EPAS1 序列聚類為不同進(jìn)化枝泛北極區(qū)LW和狗的（圖4 B）秘通。我們注意到，HAW的 EPAS1 被分配到TD的多樣性范圍內(nèi)敛熬，這可能是由于本研究中HAW的取樣有限或HAW最近的種群下降導(dǎo)致該地區(qū)多樣性大幅下降肺稀。
如圖4b所示，HAW + TD分支的位置隨 EPAS1 鄰近區(qū)域的長度而變化应民。 利用 EPAS1 基因和兩側(cè)50kb區(qū)域產(chǎn)生的數(shù)據(jù)表明HAW和TD攜帶的獨(dú)特適應(yīng)性序列是金豺的基礎(chǔ)譜系话原。 然而，當(dāng)側(cè)翼區(qū)域從兩側(cè)的50 kb增加到100和300 kb時诲锹，這個分支進(jìn)入了金豺狼譜系繁仁。 最后，當(dāng)側(cè)翼區(qū)域增加到400 kb時归园，HAW + TD分支成為狼和狗分支的姐妹支黄虱，類似于使用“發(fā)散”序列（圖2C)構(gòu)建的樹。 這是不足為奇的庸诱，這些拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的差異可能歸因于HAW和狗對 EPAS1 的強(qiáng)烈選擇和通過重組而分解跨越 EPAS1 的片段的綜合效應(yīng)捻浦。 根據(jù)這些數(shù)據(jù)，我們假設(shè)高原犬中存在的適應(yīng)性 EPAS1 等位基因既不是從LWs也不是從LDs傳入的桥爽，而是從兩者的祖先血統(tǒng)傳入的朱灿。
由于EPAS1 在很強(qiáng)的正選擇下進(jìn)化，適應(yīng)性突變的出現(xiàn)和蔓延可能會混淆系統(tǒng)發(fā)生推斷钠四。我們在10號染色體含有EPAS1 的區(qū)域(Chr10:48,551,410-48,694,966盗扒；143.5kb)共鑒定了1,242個變異體，其中500個在TD中的頻率>88.2%,在LD中<10%（圖4A)形导。 我們在基因組上沒有發(fā)現(xiàn)其他區(qū)域有如此多的連鎖變異在兩個群體之間的頻率上達(dá)到了類似的極端差異环疼。 為了測試選擇作用于從頭突變(SDN)或常設(shè)變異(SSV)是否會導(dǎo)致這種模式（許多高度分化的位點(diǎn)），我們假設(shè)在不同選擇強(qiáng)度和重組率下的兩種可能情況朵耕，模擬了143.5kb的區(qū)域。 我們發(fā)現(xiàn)EPAS1 區(qū)高度分歧位點(diǎn)的數(shù)量明顯大于模擬數(shù)據(jù)（圖4c)淋叶，表明SDN模型和SSV模型都不能解釋EPAS1 中觀察到的模式阎曹。由于包括EPAS1 在內(nèi)的系統(tǒng)發(fā)育包括青藏高原的狼和狗都是狗和所有其他灰狼基礎(chǔ)譜系（圖4B和圖S18），我們假設(shè)該等位基因產(chǎn)生于一種古老的狼樣犬科動物，它很可能棲息在QTP的高海拔地區(qū)处嫌。
