今天和大家分享的是2020年3月發(fā)表在Frontiers in Genetics（IF：3.517)上的一篇文章厘肮，“Modulator-Dependent RBPs Changes Alternative Splicing Outcomes in Kidney Cancer”，文章中作者使用TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中的腎透明細(xì)胞癌數(shù)據(jù)集诞外，以MISO軟件計(jì)算可變剪接事件的包含率鲸伴，進(jìn)一步通過(guò)構(gòu)建調(diào)節(jié)劑-RBP-AS三元組府蔗，分析調(diào)節(jié)劑對(duì)RBPs的AS調(diào)控功能的影響。

Modulator-Dependent RBPs Changes Alternative Splicing Outcomes in Kidney Cancer

腎癌中調(diào)節(jié)劑依賴的RBPs改變可變剪接的結(jié)果

一汞窗、研究背景

腎細(xì)胞癌（RCC）是一種是一種常見的惡性腫瘤姓赤，占所有新發(fā)癌癥病例的4.2％，具有放療和化療耐藥性仲吏，目前手術(shù)仍是一線治療方案不铆。并且經(jīng)過(guò)早期手術(shù)治療仍有30％的患者最終發(fā)生轉(zhuǎn)移蝌焚，而轉(zhuǎn)移性的腎透明細(xì)胞癌（KIRC）的患者2年生存率不到20％。RNA可變剪接（AS）失調(diào)的產(chǎn)物被認(rèn)為是潛在的生物標(biāo)志物誓斥，在疾病中具有關(guān)鍵作用综看。AS事件很大程度上受到RNA結(jié)合蛋白（RBPs）的調(diào)控，而RBP的調(diào)控作用受到特定細(xì)胞刺激下調(diào)節(jié)劑（如信號(hào)蛋白岖食，miRNA红碑，lncRNA等分子）的影響。作者希望揭示調(diào)節(jié)劑泡垃、RBPs與AS之間的關(guān)系析珊。

二、分析流程

三蔑穴、結(jié)果解讀

1.調(diào)節(jié)劑-RBP-AS三元組的構(gòu)建方法與調(diào)節(jié)劑作用的分類方法

數(shù)據(jù)來(lái)源：

RBPs與調(diào)節(jié)劑表達(dá)數(shù)據(jù)：TCGA-KIRC數(shù)據(jù)庫(kù)中下載的480名KIRC患者的RNA-seq數(shù)據(jù)忠寻。

AS的量化數(shù)據(jù)：使用MISO軟件計(jì)算樣本中AS事件的包含率（PSI,percent spliced isoform），保留在全部480個(gè)樣本中至少100個(gè)樣本PSI值大于0.1的事件存和，對(duì)原始AS事件進(jìn)行處理以生成高置信度事件（總樣本的約21％）奕剃。本研究?jī)H關(guān)注外顯子跳躍skipped exon（SE）事件。

RBPs的結(jié)合信息：從ENCODE數(shù)據(jù)庫(kù)下載的150個(gè)RBPs的ECLIP-Seq數(shù)據(jù)作為結(jié)合信息捐腿。

從Ensemble下載hg19參考基因組纵朋。

數(shù)據(jù)過(guò)濾：僅保留 log2 (CPM) >= 1的表達(dá)數(shù)據(jù)以及在全部480個(gè)樣本中至少100個(gè)樣本PSI值大于0.1，且PSI的變異系數(shù)（CV）大于0.1的事件茄袖。

使用線性回歸模型預(yù)測(cè)可能的triplets（三元組）

Ytarget為目標(biāo)基因的AS結(jié)果操软，Xrbp和Xm分別為RBP和調(diào)節(jié)劑對(duì)AS結(jié)果的單獨(dú)作用，XrbpXm為二者的共同作用宪祥，如果RBP與調(diào)節(jié)劑的互作可以影響AS結(jié)果聂薪，那么模型中β3不為0。作者篩選出其中β3不為0的三元組進(jìn)行下一步分析蝗羊。

接著作者在每一個(gè)三元組中根據(jù)調(diào)節(jié)劑的表達(dá)水平將樣本分為高和低（前33％和后33％）兩組藏澳，分別計(jì)算RBP表達(dá)量與AS結(jié)果的PSI值的皮爾遜相關(guān)系數(shù)PCCs。

最后比較兩組間的ΔPCCs來(lái)確定調(diào)節(jié)劑的功能模式：“attenuates splicing” 耀找，“enhances splicing”翔悠，“inverts splicing”（減弱，增強(qiáng)涯呻，反轉(zhuǎn)）凉驻。如表一所示，作者根據(jù)|PCClow|复罐、|PCChigh|以及p值將調(diào)節(jié)功能定義為減弱/增強(qiáng)外顯子排除/包含涝登，外顯子包含/排除反轉(zhuǎn)為排除/包含這6種模式。

圖1：工作流程圖效诅，調(diào)節(jié)劑-RBP-AS triplets的構(gòu)建與調(diào)節(jié)劑作用分類

表1：調(diào)節(jié)劑介導(dǎo)的RBP剪接調(diào)控類別

2.確定腎癌中QKI的調(diào)節(jié)劑

作者使用上述方法在TCGA-KIRC數(shù)據(jù)中鑒定了1,040,254個(gè)FDR<=0.01的潛在三元組胀滚，經(jīng)過(guò)數(shù)據(jù)過(guò)濾后最終確定了調(diào)控AS結(jié)果數(shù)量最多的RNA結(jié)合蛋白Quaking (QKI)趟济，對(duì)應(yīng)2,014個(gè)Modulator-QKI-Splicing三元組（包含1,101個(gè)調(diào)節(jié)劑，187個(gè)剪接事件和130個(gè)相應(yīng)基因）咽笼。作者對(duì)這些調(diào)節(jié)劑的功能進(jìn)行了分析顷编。

圖A展示了2,014個(gè)三元組的調(diào)節(jié)作用在6個(gè)模式中的分布。作者發(fā)現(xiàn)作用于多個(gè)剪接事件的調(diào)節(jié)劑大多數(shù)具有多種作用模式剑刑，并且同一調(diào)節(jié)劑作用于QKI的不同AS事件媳纬，結(jié)果可能是相反的。

比如在ARMH4-QKI-CLTC中施掏，ARMH4低表達(dá)時(shí)QKI的表達(dá)量增加與CLTC外顯子的包含有關(guān)钮惠，ARMH4高表達(dá)時(shí)QKI的表達(dá)量增加與CLTC外顯子的排除有關(guān)。而在ARMH4-QKI-STIM1中七芭，ARMH4從低表達(dá)到高表達(dá)時(shí)素挽，QKI表達(dá)量與STIM1外顯子包含率的相關(guān)性是增加的。

作者認(rèn)為這一發(fā)現(xiàn)表明不同的調(diào)節(jié)模式依賴于調(diào)節(jié)劑-RBP-AS三元組狸驳，而不是特定的RBP或目標(biāo)基因预明，即調(diào)節(jié)劑的表達(dá)水平可以影響RBPs對(duì)AS結(jié)果的調(diào)控功能。

作者以調(diào)節(jié)劑的作用模式對(duì)三元組進(jìn)行聚類耙箍，同一組中的調(diào)節(jié)劑傾向于以同種模式對(duì)QKI的剪接作用進(jìn)行調(diào)節(jié)（圖B）撰糠，表明這些調(diào)節(jié)劑可以作為QKI的拮抗劑或激活劑來(lái)影響AS結(jié)果。

作者進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)許多調(diào)節(jié)劑作用于相同的QKI剪接目標(biāo)究西，提示這些調(diào)節(jié)劑可能在相關(guān)途徑中共表達(dá)或者具有相似的功能窗慎。

圖C展示了QKI調(diào)節(jié)劑的相關(guān)性熱圖，可以看到結(jié)果聚為明顯的四類卤材。

KEGG通路富集結(jié)果顯示這些調(diào)節(jié)劑在細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用，Th1和Th2細(xì)胞分化等通路中顯著富集（圖D）峦失。

圖E展示了根據(jù)基因的生物類型和特征對(duì)QKI調(diào)節(jié)劑的分類結(jié)果（包括免疫相關(guān)基因扇丛，轉(zhuǎn)錄因子和lncRNA）。

圖2：RNA結(jié)合蛋白QKI相關(guān)調(diào)節(jié)劑的鑒定

3.QKI調(diào)節(jié)劑的功能分析

作者從三類調(diào)節(jié)劑中挑選了六個(gè)尉辑，包括免疫基因（CCL3帆精，HLA-F，AGER）隧魄，轉(zhuǎn)錄因子（ARMH4卓练，STAT4）和lncRNA（LINC01268），展示QKI-splicing-調(diào)節(jié)劑之間的調(diào)節(jié)關(guān)系购啄。三維散點(diǎn)圖中藍(lán)色和紅色分別表示調(diào)節(jié)劑表達(dá)低和高兩組的樣品襟企，并擬合了QKI-splicing-調(diào)節(jié)劑的回歸平面。（圖3）

圖3：QKI-splicing-調(diào)節(jié)劑的相關(guān)性

作者進(jìn)一步研究AS失調(diào)與KIRC發(fā)展之間的關(guān)系狮含，在TCGA-KIRC數(shù)據(jù)集中分析了腎癌樣本與正常樣本間的調(diào)節(jié)劑表達(dá)差異以及生存差異顽悼，結(jié)果顯示大部分調(diào)節(jié)劑具有表達(dá)差異并與生存相關(guān)曼振。

圖A，B展示其中對(duì)目標(biāo)基因AS影響最為顯著的10個(gè)調(diào)節(jié)劑蔚龙”溃可以看到箱線圖中腫瘤組織（紅色框）與正常組織（灰色框）調(diào)節(jié)劑表達(dá)水平具有顯著差異。生存分析中以調(diào)節(jié)劑表達(dá)水平中值將樣本分為高表達(dá)組和低表達(dá)組木羹，可以看到組間具有顯著生存差異甲雅。

KEGG通路富集顯示，QKI調(diào)節(jié)劑在腫瘤進(jìn)展相關(guān)通路中存在富集（圖C）坑填。GO富集分析顯示調(diào)節(jié)劑在轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)的過(guò)程中富集务荆，包括RNA剪接、細(xì)胞生長(zhǎng)和蛋白結(jié)合等（圖D-F）穷遂。作者認(rèn)為富集結(jié)果表明QKI主要在剪接水平對(duì)基因進(jìn)行調(diào)控函匕，當(dāng)調(diào)節(jié)劑對(duì)QKI表達(dá)水平進(jìn)行干擾時(shí)，QKI的RNA結(jié)合蚪黑、剪接和調(diào)控等功能失調(diào)盅惜。

圖G中作者使用Network of Cancer Genes (NCG) ?和 Tumor suppressor gene database (TSGene) 數(shù)據(jù)庫(kù)鑒定調(diào)節(jié)劑中的腫瘤相關(guān)基因。結(jié)果顯示149（13%）個(gè)調(diào)節(jié)劑基因?yàn)镹CG中的腫瘤驅(qū)動(dòng)基因忌穿，77（7%）個(gè)為TSGene中的蛋白質(zhì)編碼抑癌基因抒寂。

圖4：QKI調(diào)節(jié)劑的功能分析

4.分析腎癌中調(diào)節(jié)劑影響的CTNND1剪接結(jié)果

CTNND1的第20號(hào)外顯子剪接是相關(guān)調(diào)節(jié)劑最多的AS事件：“chr11:57582866: 57582972: + @ chr11: 57583387:57583473: + @ chr11:57583769: 57586652:+”，已有研究顯示CTNND1編碼Armadillo蛋白家族中的一個(gè)成員掠剑，該成員在細(xì)胞黏附與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮作用屈芜。多種CTNND1剪接亞型在細(xì)胞中表達(dá)，僅表達(dá)full-length CTNND1的細(xì)胞具有侵襲性朴译。

在CTNND1的相關(guān)調(diào)節(jié)劑中鑒定出了107個(gè)減弱外顯子排除和7個(gè)增強(qiáng)外顯子排除的調(diào)節(jié)劑井佑。圖A為剪接調(diào)控示意圖。

圖B中作者展示了其中四種調(diào)節(jié)劑的作用眠寿，可以看到調(diào)節(jié)劑高低表達(dá)組中QKI的剪接調(diào)控作用明顯不同躬翁。TNFRSF14低表達(dá)組中QKI表達(dá)量與CTNND1 PSI之間的相關(guān)系數(shù)為-0.38 (p = 1.7e-05)，而在TNFRSF14高表達(dá)組中兩者不具有相關(guān)性(correlation = 0.001, p = 0.98)盯拱，表明TNFRSF14的高表達(dá)可能抑制QKI的剪接活性盒发。

以上結(jié)果表明差異表達(dá)的調(diào)節(jié)劑可以改變QKI在調(diào)控CTNND1剪接結(jié)果中的作用，作者認(rèn)為這種調(diào)節(jié)模式為研究疾病相關(guān)的AS失調(diào)提供了新的思路狡逢。

圖5：KIRC中CTNND1的剪接結(jié)果受相關(guān)調(diào)節(jié)劑表達(dá)水平的影響

小結(jié)

??這篇文章中作者主要是使用一種新穎的工作框架研究調(diào)節(jié)劑-RBPs-AS結(jié)果之間的調(diào)節(jié)作用宁舰，在可變剪接的調(diào)控中提供了一條新的研究思路。首先作者使用MISO軟件計(jì)算TCGA-KIRC中480例樣本的AS事件的PSI奢浑，接著計(jì)算RBPs表達(dá)水平與PSI的相關(guān)性系數(shù)PCC蛮艰，并以線性回歸模型建立調(diào)節(jié)劑-RBPs-AS結(jié)果三元組，然后以調(diào)節(jié)劑表達(dá)水平將三元組中的樣本分為高低兩組殷费，計(jì)算組間的PCC差值印荔，從而確定調(diào)節(jié)劑的調(diào)控模式低葫。作者進(jìn)一步選出其中調(diào)控AS最多的RNA結(jié)合蛋白QKI和對(duì)應(yīng)最多調(diào)節(jié)劑的AS事件，對(duì)三元組的調(diào)控關(guān)系進(jìn)行了展示仍律，并對(duì)調(diào)節(jié)劑基因進(jìn)行了KEGG和GO富集嘿悬，分析其在KIRC中的可能作用，最后得出KIRC中調(diào)節(jié)劑影響RBPs的AS調(diào)控作用水泉，且AS的失調(diào)與腫瘤進(jìn)展相關(guān)善涨。