前些日子小編下載單細胞RNA測序數(shù)據(jù)時，發(fā)現(xiàn)一個奇怪的現(xiàn)象：明明是一個雙端測序的單細胞RNA測序數(shù)據(jù)豆励，但是數(shù)據(jù)下載界面只看到1 read per spot夺荒，且read讀長為98bp（圖1），熟悉10x單細胞文庫結(jié)構(gòu)的朋友們不難推測出來它是R2文件（也就是轉(zhuǎn)錄本reads）良蒸，并不包含barcode和UMI信息技扼，那么這份數(shù)據(jù)是不是就不能下載使用了呢？我們應該去哪找barcode和UMI信息呢嫩痰？
眾所周知剿吻，10x的單細胞轉(zhuǎn)錄組測序文庫采用雙端測序，所以理論上我們在數(shù)據(jù)下載界面至少要看到2 reads per spot串纺，分別包括R1（26bp：barcode和UMI序列）丽旅、R2（98bp：插入片段）。以圖2數(shù)據(jù)為例纺棺，可以看到數(shù)據(jù)集中每個spot由三部分組成榄笙，根據(jù)測序數(shù)據(jù)堿基長度就可推測它們分別是R1、R2和I1（8bp：index序列）祷蝌。
先給大家說說為什么會有這種情況出現(xiàn)：
這是因為10x單細胞數(shù)據(jù)在實際上傳的時候茅撞，很多人會選擇上傳bam文件，而不是fastq文件（除了fastq文件以外巨朦，SRA鼓勵提交10x bam文件）米丘。bam是Cellranger生成的輸出文件之一，主要存儲測序數(shù)據(jù)和參考基因組比對結(jié)果糊啡，由于其特殊高效的壓縮算法拄查，使得它的文件大小偏小，便于傳輸棚蓄。而10x單細胞文庫比較特殊堕扶，雙端測序獲得的兩個文件中僅R2文件包含mRNA反轉(zhuǎn)錄后的cDNA信息，這就使得bam文件中一條read ID僅對應一行插入片段信息梭依，而barcode和UMI以tag的形式存在于bam文件中挣柬。當作者在GEO數(shù)據(jù)庫中僅上傳bam文件時，系統(tǒng)會對提交的數(shù)據(jù)進行一系列格式轉(zhuǎn)換睛挚，所以我們最終看到的便是只有1 read per spot邪蛔，在tag中的barcode UMI信息不見了。
因此要獲得該數(shù)據(jù)集的barcode和UMI信息扎狱，需要獲取作者上傳的原始bam文件侧到。點開Data access選項（一般我們進入的SRR數(shù)據(jù)的位置其實是Metadata頁面），會發(fā)現(xiàn)Original format中提供了原始bam文件（圖3）淤击。
我們可以將Data access選項卡中找到的bam文件下載匠抗，下載的bam文件再使用10x官方提供的Cellranger里的工具bamtofastq將其轉(zhuǎn)換為fastq格式文件（見圖4-5）。就可以進行后續(xù)分析啦～
bamtofastq官網(wǎng)：https://github.com/10XGenomics/bamtofastq
#通過bamtofastq將bam轉(zhuǎn)成fastq./cellranger/lib/bin/bamtofastq --nthreads=8 P1TLH.bam.1 /output/2fq_P1TLH.bam.1
小知識
單細胞測序原始文件還可通過ENA數(shù)據(jù)庫進行下載（https://www.ebi.ac.uk/ena/browser/home）污抬，這個數(shù)據(jù)庫由EMBL-Bank 核酸序列數(shù)據(jù)庫基礎(chǔ)上發(fā)展起來汞贸，EMBL數(shù)據(jù)直接來源于測序工作者提交的數(shù)據(jù)绳军，主要優(yōu)勢：界面簡潔友好，數(shù)據(jù)源直接以表格呈現(xiàn)矢腻，且可直接得到原始數(shù)據(jù)文件的下載地址门驾。比如圖1數(shù)據(jù)，可直接在搜索欄輸入SRR7276478多柑，就可獲得bam文件下載鏈接奶是。
所以，在下載10x單細胞原始數(shù)據(jù)時竣灌，除了用sra-tools將SRA數(shù)據(jù)分為R1聂沙、R2、I1三個fastq.gz文件外初嘹；我們還可以直接下載bam文件（此時需注意不要再下載SRA數(shù)據(jù)了）及汉，千萬別只看到1 read per spot就覺得這個數(shù)據(jù)不能用，然后就把它放棄了屯烦。
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