一煞茫、不求甚解系列
軟件下載及配置
conda安裝：
conda install -c bioconda homer使用
configureHomer.pl完成HOMER軟件的配置
# 下載配置文件
wget http://homer.salk.edu/homer/configureHomer.pl
?
# 使用配置文件進(jìn)行軟件配置
perl configureHomer.pl -install
?
# 下載 hg19 人的參考基因組
# 將hg19替換為mm10可下載mm10 小鼠的參考基因組
# 因?yàn)檎n題組人和小鼠的研究居多摇庙，這里只以這兩者舉例
perl configureHomer.pl -install hg19
Motif 分析及peak注釋
此處以 MACS2 軟件call peak得到的bed文件舉例：
HOMER軟件接受兩種文件格式，這里不展開介紹文件的具體格式哪廓，細(xì)節(jié)可看使用詳解系列
findMotifsGenome.pl H3K4Me3.bed hg19 H3K4Me3_motif -len 8,10,12
# peak文件：ChIP-Seq_H3K4Me3_1_homer.bed
# 基因組版本：hg19
# 輸出路徑：ChIP-Seq_H3K4Me3_1_motifDir
# motif長(zhǎng)度：-len 8,10,12
# motif的軟件默認(rèn)長(zhǎng)度為8，10，12
?
annotatePeaks.pl H3K4Me3.bed hg19 1> ChIP-Seq_H3K4Me3_1_peakAnn.xls 2>H3K4Me3_annLog.txt </pre>
結(jié)果展示
軟件運(yùn)行后的結(jié)果全部放在我們制定的輸出文件路徑下，將該目錄下所有文件下載到本地立镶，打開homerResults.html 文件，即可得到如下結(jié)果展示：
隨便找的一個(gè)例子类早，不一定是H3K4me3的motif
二媚媒、使用詳解
HOMER 一個(gè)常用的motif分析軟件。它通過比較兩個(gè)序列集涩僻，并使用ZOOPS scoring和超幾何分布（或者負(fù)二項(xiàng)分布）進(jìn)行motif的富集分析缭召。它主要用于ChIP-seq和promoter分析，但也可以用于核酸序列的motif分析問題逆日。
HOMER軟件可以進(jìn)行多種類型的motif分析嵌巷，如 promoter motif analysis ，基因組位置motif分析(ChIP-seq分析中的motif分析)室抽，利用自定義的fasta文件進(jìn)行motif分析搪哪，RNA序列的motif分析（分析CLIP-seq數(shù)據(jù)中的RNA binding elements）
HOMER進(jìn)行motif分析時(shí)，需要兩個(gè)數(shù)據(jù)集：
感興趣的目標(biāo)序列坪圾，如ChIP-seq分析中的peak文件
背景序列晓折，如ChIP-seq分析中的物種全基因組序列
HOMER包的介紹與安裝
HOMER包分為四種：
SOFTWARE： 軟件包，里面包括所有的代碼以及一些常見的數(shù)據(jù)文件神年，如motif矩陣
ORGANISMS：物種特異性數(shù)據(jù)包已维，包括一些指定物種的accession conversion數(shù)據(jù)，gene description數(shù)據(jù)已日，GO 分析數(shù)據(jù)垛耳。大部分?jǐn)?shù)據(jù)都是以NCBI的gene數(shù)據(jù)庫(kù)為基礎(chǔ)的
PROMOTERS：?jiǎn)?dòng)子數(shù)據(jù)包，對(duì)promoter進(jìn)行motif分析時(shí)所需要的相關(guān)數(shù)據(jù)和promoter序列信息飘千。大部分?jǐn)?shù)據(jù)都是基于RefSeq 轉(zhuǎn)錄組堂鲜。
Genomes：基因組數(shù)據(jù)包，包括一些基因組序列和注釋信息
HOMER軟件的安裝可看不求甚解部分护奈。HOMER軟件剛安裝之后缔莲，是不包含任何序列信息的。我們可以使用 configureHOMER.pl 腳本下載所需數(shù)據(jù)霉旗。 我們可以使用 perl configureHOMER.pl -list 命令得到已有的HOMER包痴奏。
有些軟件包的名稱后面會(huì)跟有 -o, -p, -g等參數(shù)蛀骇，這是HOMER為了區(qū)分同一物種不同類型數(shù)據(jù)所添加的。如 human-p读拆。其中 -o 表示organism擅憔，-p 表示promoter，-g 表示genome檐晕。 這里給出幾個(gè)軟件包安裝與刪除的例子：
# install 表示安裝
perl configureHomer.pl -install mouse # 安裝小鼠的promoter數(shù)據(jù)集
perl configureHomer.pl -install hg19 # 安裝人的hg19版本的基因組數(shù)據(jù)集
?
# remove 表示刪除
perl configureHomer.pl -remove mm10 # 刪除小鼠mm10版本的基因組數(shù)據(jù)
此外暑诸，需要注意的是，當(dāng)我們下載基因組數(shù)據(jù)時(shí)辟灰，同時(shí)會(huì)自動(dòng)下載物種包的數(shù)據(jù)（比如个榕，下載hg19數(shù)據(jù)時(shí)，會(huì)自動(dòng)下載human數(shù)據(jù)）芥喇。每次我們下載某個(gè)物種的基因組數(shù)據(jù)或者promoter數(shù)據(jù)時(shí)西采，它都會(huì)自動(dòng)替我們檢查是否下載了對(duì)應(yīng)的物種數(shù)據(jù)。
motif分析
正如前面所說乃坤，HOMER可以進(jìn)行多種類型的motfi分析苛让。這里我們以最常見的ChIP-seq流程中的peaks motfi分析舉例。該分析需要使用 findMotifsGeome.pl 腳本湿诊。
該腳本的輸入文件支持兩種類型的文件，一種是常見的bed文件格式(MACS2軟件call peak得到的bed文件即可直接使用)瘦材，另一種是HOMER軟件指定使用的peak文件格式厅须。 下面詳細(xì)講一下這兩種文件格式:
bed文件格式：
findMotifsGeome.pl腳本用到的信息為bed文件的前六列，分別是chr,start,end,peak ID,score(HOMER用不到該信息食棕，但是必須有),strand朗和。peak文件格式：該文件格式需要五列信息（使用Tab分隔），分別是
peak ID,chr,start,end,strand簿晓。
當(dāng)我們準(zhǔn)備分析一個(gè)peak/bed文件的motif時(shí)眶拉，需要運(yùn)行以下命令：
findMotifsGenome.pl <peak/BED file> <genome> <output directory> -size # [options]
# 比如： findMotifsGenome.pl ERpeaks.txt hg18 ER_MotifOutput -size 200 -mask
-mask: 該參數(shù)告訴motif分析程序，在得到一個(gè)可能的motif之后憔儿，在后續(xù)的motif分析中是否排除該motif的影響忆植。有點(diǎn)類似于抽樣調(diào)查中的無放回抽樣。-size: 指定用于motif分析的片段長(zhǎng)度谒臼，默認(rèn)為200朝刊；-size given設(shè)置片段大小為目標(biāo)序列長(zhǎng)度。越大蜈缤，motif分析所需要的計(jì)算資源越多拾氓。
下面介紹一些常用的其他參數(shù)：
-p: 設(shè)置線程數(shù)-S: 所尋找的motif數(shù)目，默認(rèn)為25底哥。25已經(jīng)不算少了咙鞍，如果自定義數(shù)目房官，推薦設(shè)置更少而不是更多。-mis: 所允許的錯(cuò)配數(shù)续滋，默認(rèn)為2-cpg: 在對(duì)背景序列和目標(biāo)序列進(jìn)行normalization時(shí)翰守，使用CpG%矯正而非GC%。norevopp: 只在peak所在的鏈搜索motif吃粒，不進(jìn)行反義鏈搜索潦俺。HOMER默認(rèn)會(huì)在兩條鏈上都進(jìn)行搜索。-rna: 搜索RNA上的motif（如使用CLIP-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行分析的時(shí)候）-bg: 指定自定義的背景序列徐勃。HOMER默認(rèn)隨機(jī)選取基因組序列作為背景事示。-h:findMotifsGenome.pl腳本默認(rèn)使用二項(xiàng)分布進(jìn)行motif富集分析，這在背景序列多于目標(biāo)序列時(shí)是十分有用的僻肖。但是有時(shí)我們使用-bg參數(shù)自定義背景序列時(shí)肖爵，其數(shù)目可能會(huì)小于目標(biāo)序列，此時(shí)使用-h參數(shù)選擇超幾何分布會(huì)更加適合臀脏。-len: motif的長(zhǎng)度設(shè)置劝堪，默認(rèn)8，10揉稚，12秒啦，越大越消耗計(jì)算資源。-N: 用于motif分析時(shí)所需的序列數(shù)目搀玖，通常當(dāng)我們?cè)O(shè)置-len過大余境，內(nèi)存不夠時(shí)，會(huì)選擇減小-N參數(shù)或者-size參數(shù)灌诅。
三芳来、原理
前面我們說到，HOMER軟件可以進(jìn)行多種類型的motif分析猜拾，如 promoter motif analysis 即舌，基因組位置motif分析(ChIP-seq分析中的motif分析)，利用自定義的fasta文件進(jìn)行motif分析挎袜，RNA序列的motif分析（分析CLIP-seq數(shù)據(jù)中的RNA binding elements）顽聂。 但是，不管我們?nèi)绾握{(diào)用HOMER宋雏，對(duì)于發(fā)現(xiàn)motif的基本步驟都是一致的芜飘，下面主要介紹一下各步驟的原理：
原理理解即可，HOMER已經(jīng)將各個(gè)步驟封裝起來磨总，不用一步一步分別進(jìn)行嗦明。
預(yù)處理
1. 序列提取
若給出的基因組位置信息，則提取出來的是對(duì)應(yīng)的基因組序列蚪燕；
若給出的是基因accession number娶牌，給需要選擇適當(dāng)?shù)膒romoter區(qū)域
2. 背景選擇
如果沒有自定義背景序列信息（即： -bg 參數(shù)）奔浅，HOMER將自動(dòng)為用戶選取。如果使用的是基因組位置诗良，將從整個(gè)基因組序列抓取GC含量一致的序列作為背景序列汹桦。若進(jìn)行的是promoter分析，則將所有的promoter作為背景鉴裹。
3. GC含量矯正
將目標(biāo)序列和背景序列對(duì)GC含量進(jìn)行分bin（5%區(qū)間）舞骆，背景序列通過調(diào)節(jié)權(quán)重得到和目標(biāo)序列同樣的GC含量分布。這可以使得HOMER在分析來自CpG島時(shí)的序列時(shí)径荔，不會(huì)簡(jiǎn)單的找到那些GC富集的motif督禽。下圖是一個(gè)ChIP-seq分析中GC含量分bin的例子
4. 自動(dòng)標(biāo)準(zhǔn)化
除了GC含量之外，目標(biāo)序列還會(huì)存在其他的情況影響分析結(jié)果总处。如外顯子上的密碼子偏好等生物學(xué)現(xiàn)象狈惫，由A富集序列優(yōu)先排列引起的實(shí)驗(yàn)偏差。當(dāng)這些偏差顯著時(shí)鹦马，將會(huì)影響HOMER的motif分析胧谈。HOMER通過給背景序列分配適當(dāng)?shù)臋?quán)重，減少寡核苷酸序列頻率（如AA）在背景與目標(biāo)的差異荸频。
重頭預(yù)測(cè)motif
默認(rèn)情況下HOMER調(diào)用homer2版本菱肖，若想使用舊版本，在命令行中添加
-homer1參數(shù)即可
5. 解析輸入序列
根據(jù)設(shè)置的motif長(zhǎng)度旭从，將輸入序列解析為寡核苷酸蔑滓，并生成一個(gè)寡核苷酸頻度表。該表只記錄出現(xiàn)的寡核苷酸和其出現(xiàn)的次數(shù)遇绞，可以增加motif搜索時(shí)的效率，但是也會(huì)破壞寡核苷酸與其原始序列的關(guān)系燎窘。
6. 寡核苷酸自動(dòng)均一化
HOMER除了在第四步中對(duì)全局序列進(jìn)行了自動(dòng)均一化矯正摹闽，還在寡核苷酸頻度表中進(jìn)行了矯正。該方法的主要思想是將那些較短的寡核苷酸與較長(zhǎng)的寡核苷酸相平衡褐健，但是該方法由于存在許多與motif同長(zhǎng)的寡核苷酸付鹿，需要分配數(shù)量眾多的權(quán)重。對(duì)于那些極端的序列偏好蚜迅，該方法不會(huì)移除它們舵匾。
7. 全局搜索
在構(gòu)建好寡核苷酸頻度表后，HOMER進(jìn)行全局motif搜索谁不。其基本原理就是若某個(gè)motif富集坐梯，則其存在的寡核苷酸也同樣富集。為了增加靈敏度刹帕，HOMER允許搜索motif時(shí)的錯(cuò)配吵血，同時(shí)跳過多個(gè)錯(cuò)配的寡核苷酸節(jié)省計(jì)算資源谎替。
8. 矩陣優(yōu)化
9. Mask and Repeat
當(dāng)最優(yōu)oligo被優(yōu)化成motif后，motif 對(duì)應(yīng)的序列從要分析的數(shù)據(jù)中移除蹋辅，接下來再分析最優(yōu)的…..直到設(shè)定個(gè)數(shù)的motif被發(fā)現(xiàn)钱贯。
搜索已知的motif（homer2版本）
10. 加載moitf數(shù)據(jù)庫(kù)
HOMER從以前的數(shù)據(jù)中加載一個(gè)已知的motif列表從而搜索已知的motif還可以通過在命令行中指定的motif( -mknown)或通過編輯homer包中的文件( data/knownTFs/known.motifs )來添加motifs。
11. 掃描所有的motif
HOMER通過掃描所有的序列侦另，確定每個(gè)motif的富集度秩命，并計(jì)算其顯著性。
motif輸出的結(jié)果分析
12. Motif文件
HOMER的輸出有許多后綴名為 motif 的文件褒傅，其內(nèi)容如下：
每個(gè)motif信息是一塊弃锐，均以>開頭。>所在行的信息以tab分隔樊卓。 motif首行信息解釋：
>+ 一致性序列：如圖上的>ASTTCCTCTTMotif名稱：如圖上的1-ASTTCCTCTT
比值檢測(cè)概率的log值：8.059752
P-value得log值：-23791.535714
占位符：如上圖得0拿愧，不具有任何信息
-
逗號(hào)分隔得富集信息，如：T:17311.0(44.36%),B:2181.5(5.80%),P:1e-10317
T表示帶有該motif的目標(biāo)序列在總的目標(biāo)序列（target）中得百分比B表示帶有該motif的背景序列在總的背景序列（background）中得百分比P表示最終富集的p-value
-
逗號(hào)分隔的motif統(tǒng)計(jì)信息碌尔，如：Tpos:100.7,Tstd:32.6,Bpos:100.1,Bstd:64.6,StrandBias:0.0,Multiplicity:1.13
Tpos：motif在目標(biāo)序列中的平均位置
Tstd：motif在目標(biāo)序列中位置的標(biāo)準(zhǔn)差
Bpos：motif在背景序列中的平均位置
Bstd：motif在背景序列中位置的標(biāo)準(zhǔn)差
StrandBias: 鏈偏好性浇辜，在正義鏈上的motif數(shù)與反義鏈motif數(shù)的比值的log
Multiplicity：具有一個(gè)或多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的序列中每個(gè)序列的平均出現(xiàn)次數(shù)
13 denovo預(yù)測(cè)的motif
首先對(duì)產(chǎn)生的motif進(jìn)行去冗余，然后將motif轉(zhuǎn)換為向量值從而計(jì)算皮爾遜相關(guān)系數(shù)唾戚。HOMER產(chǎn)生的motif結(jié)果使用網(wǎng)頁(yè)展示柳洋，該文件名稱為 homerResults.html ，而目錄homerResults/ 存放著所有該網(wǎng)頁(yè)依賴的文件和圖片叹坦。生成的motif首先去冗余熊镣。以下是一個(gè)簡(jiǎn)單的輸出示例：
輸出結(jié)果按照p-value排序，最后一列是一個(gè)鏈接到motif文件的超鏈接募书，可以從這個(gè)文件中找到包含此motif的其他序列绪囱。在Best Match/Details 列中，HOMER將會(huì)展示與denovo motif最匹配的已知motif（不可全信莹捡，最匹配不一定是最優(yōu)）鬼吵。該列還包含有一個(gè)名為 More information 的超鏈接，點(diǎn)擊后會(huì)出現(xiàn)以下頁(yè)面：
該頁(yè)面包含motif的一些基本信息篮赢，如鏈接到motfi文件的超鏈接齿椅，且可以生成motif logo的pdf格式。
接著是與已知motif的match启泣。這部分主要看看denovo motif和已知的motif的相似性涣脚，需要檢查一下是否合理，如下：
如果點(diǎn)擊 Simiar motifs 超鏈接寥茫，將會(huì)展示在denovo motif搜尋過程中與該motif相似的其他motifs（這些motif的enrichment value相對(duì)較低）遣蚀。通常我們會(huì)點(diǎn)擊查看一下是否有一些motifs被不正確的分類，比如幾個(gè)motif具有幾個(gè)相同的堿基。具體界面如下：
14. 已知motif的輸出
該輸出也是以網(wǎng)頁(yè)形式展現(xiàn)妙同，頁(yè)面結(jié)果根據(jù)enrichement進(jìn)行排序射富，具體如下：
