當(dāng)前，關(guān)于高通量蛋白質(zhì)組學(xué)的研究遠(yuǎn)不如NGS這般火熱割择，網(wǎng)上關(guān)于這方面的知識(shí)也寥寥無(wú)幾眷篇，從事這一行也有一段時(shí)間了，但還沒(méi)好好總結(jié)過(guò)荔泳。加之過(guò)段時(shí)間可能要去做培訓(xùn)蕉饼，所以是時(shí)候把知識(shí)點(diǎn)總結(jié)一下虐杯，權(quán)當(dāng)復(fù)習(xí)。當(dāng)然整個(gè)蛋白質(zhì)組學(xué)研究也算紛繁復(fù)雜昧港，不可能面面俱到厦幅，而且很多東西我也在學(xué)習(xí)當(dāng)中，肯定會(huì)出現(xiàn)不少紕漏慨飘。畢竟這份筆記主要還是用于自我查漏補(bǔ)缺确憨，要是在此之外還能幫到需要的朋友，也算善莫大焉了瓤的。
這一篇從原理開始講起休弃，后續(xù)會(huì)依次總結(jié)蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定、定量圈膏、注釋塔猾、翻譯后修飾、靶向等基礎(chǔ)內(nèi)容稽坤，當(dāng)然最后也會(huì)講到下游數(shù)據(jù)分析處理丈甸。
一、蛋白質(zhì)組學(xué)概述
蛋白質(zhì)組學(xué)是特定系統(tǒng)內(nèi)蛋白質(zhì)集合及其相互作用的研究尿褪。
蛋白質(zhì)組研究本質(zhì)上指的是在大規(guī)模水平上研究蛋白質(zhì)的特征睦擂，包括蛋白質(zhì)的表達(dá)水平，翻譯后的修飾杖玲，蛋白與蛋白相互作用等顿仇，由此獲得蛋白質(zhì)水平上的關(guān)于疾病發(fā)生，細(xì)胞代謝等過(guò)程的整體而全面的認(rèn)識(shí)摆马，這個(gè)概念是在1994年Marc Wilkins首次提出的臼闻。
為什么要研究蛋白質(zhì)組學(xué)？
我想一句話就夠了：蛋白質(zhì)是生命活動(dòng)的物質(zhì)基礎(chǔ)囤采，是生命的執(zhí)行者述呐。
用業(yè)內(nèi)通俗的話說(shuō)解釋各個(gè)組學(xué)的作用就是：基因組解釋能發(fā)生什么？轉(zhuǎn)錄組解釋將發(fā)生什么蕉毯？蛋白組解釋在發(fā)生什么乓搬？代謝組解釋已發(fā)生什么？
蛋白質(zhì)組學(xué)是后基因組時(shí)代的產(chǎn)物恕刘，作為中心法則的下游缤谎，其復(fù)雜程度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)基因組學(xué)『肿牛基因組的存在是相對(duì)穩(wěn)定的坷澡，而細(xì)胞和細(xì)胞之間的蛋白質(zhì)組則是隨蛋白質(zhì)和基因以及環(huán)境的生物化學(xué)反應(yīng)而變化的。同一生物在生物體不同部位含蓉、生命的不同時(shí)期以及不同的環(huán)境中频敛，具有不同的蛋白質(zhì)表達(dá)项郊。
人類基因組測(cè)序計(jì)劃的完成并沒(méi)有給人提供解開生命的密鑰，科學(xué)家把興趣轉(zhuǎn)到蛋白質(zhì)斟赚，希望通過(guò)蛋白質(zhì)組的研究來(lái)進(jìn)一步解開生命的本質(zhì)着降。
二、質(zhì)譜儀結(jié)構(gòu)及原理
先看下面這張圖拗军，大致說(shuō)明了蛋白質(zhì)組學(xué)分析鑒定的流程任洞。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)就是樣本制備后分離進(jìn)入質(zhì)譜儀中，產(chǎn)出具有質(zhì)荷比信息的實(shí)際譜圖发侵，再和數(shù)據(jù)庫(kù)產(chǎn)生的理論譜圖進(jìn)行匹配打分交掏，從而推斷出蛋白信息。后續(xù)將會(huì)詳解這一部分刃鳄。
從上圖我們可看出高通量蛋白質(zhì)組學(xué)的研究離不開質(zhì)譜儀盅弛，要想理解蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)分析原理，首先就要明白質(zhì)譜儀的工作原理叔锐。
1.質(zhì)譜儀的發(fā)展
質(zhì)譜儀發(fā)展的幾個(gè)標(biāo)志性階段：
上世紀(jì)初挪鹏，JJ. Thomson發(fā)明第一臺(tái)質(zhì)譜儀；
40年代愉烙，質(zhì)譜儀用于同位素測(cè)定和無(wú)機(jī)元素分析讨盒；
60年代，開始出現(xiàn)氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀應(yīng)用于有機(jī)物分析齿梁；
80年代催植，以電噴霧、基質(zhì)輔助激光解析電離為基礎(chǔ)的液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀應(yīng)用于蛋白質(zhì)等生物大分子檢測(cè)勺择。
2.質(zhì)譜儀結(jié)構(gòu)
簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，質(zhì)譜儀就是用來(lái)測(cè)定氣態(tài)離子質(zhì)荷比（m/z）的儀器伦忠。首先放個(gè)圖省核，直觀感受下質(zhì)譜儀長(zhǎng)啥樣。嗯昆码，我覺(jué)得比測(cè)序儀丑气忠，但是價(jià)格卻不比測(cè)序儀便宜。
質(zhì)譜儀類型可分為無(wú)機(jī)質(zhì)譜儀赋咽、同位素質(zhì)譜儀旧噪、有機(jī)質(zhì)譜儀、生物質(zhì)譜儀脓匿。后兩者用途比較廣泛淘钟，用于蛋白質(zhì)組學(xué)分析的質(zhì)譜儀屬于生物質(zhì)譜儀，主要由以下幾種結(jié)構(gòu)組成陪毡。
1）進(jìn)樣系統(tǒng)
按物質(zhì)形態(tài)米母，無(wú)非氣體勾扭、固體、液體三種铁瞒。按進(jìn)樣方式妙色，有氣體擴(kuò)散進(jìn)樣、直接探針進(jìn)樣慧耍、色譜進(jìn)樣等身辨。
2）離子源
離子源的作用是將被分析的樣品分子電離成帶電離子，并使其在光學(xué)系統(tǒng)作用下聚成一定形狀和能量的離子束芍碧，然后進(jìn)入質(zhì)量分析器被分離煌珊。
離子源可分為硬源和軟源，硬源離子化能量高师枣，譜圖復(fù)雜怪瓶，可得到分子官能團(tuán)信息；軟源能量低践美，產(chǎn)生碎片少洗贰，譜圖簡(jiǎn)單，可得到分子離子峰陨倡。常見(jiàn)硬軟電離源如電子轟擊電離源（EI）敛滋、化學(xué)電離源（CI）、場(chǎng)致電離源（FI）兴革、場(chǎng)解析電離源（FD）绎晃、快原子轟擊電離源（FAB）、大氣壓化學(xué)電離（APCI）杂曲、大氣壓光電離(APPI)庶艾、電噴霧電離(ESI)、基質(zhì)輔助激光解析電離（MALDI）等等擎勘。
與GC串聯(lián)的離子源有電子轟擊電離源(EI)和化學(xué)電離源(CI)咱揍，常用于代謝組學(xué)。與LC串聯(lián)質(zhì)譜的離子源有電噴霧離子化(ESI)棚饵、基質(zhì)輔助激光解析電離（MALDI）大氣壓光電離(APPI)等煤裙，常用于蛋白質(zhì)組學(xué)，也正是ESI和MALDI的發(fā)明獲得了諾貝爾獎(jiǎng)噪漾。
ESI采用強(qiáng)靜電場(chǎng)(3-5KV)硼砰，形成高度荷電霧狀小液滴，經(jīng)過(guò)反復(fù)的溶劑揮發(fā)-液滴裂分后欣硼，產(chǎn)生單個(gè)多電荷離子题翰，電離過(guò)程中，產(chǎn)生多重質(zhì)子化離子，主要用于LC-MS聯(lián)用儀遍愿。
MALDI可使熱敏感或不揮發(fā)的化合物由固相直接得到離子存淫。波長(zhǎng)為1250-775的真空紫外光輻射產(chǎn)生光致電離和解吸作用，獲得分子離子和有結(jié)構(gòu)信息的碎片沼填，適于結(jié)構(gòu)復(fù)雜桅咆、不易氣化的大分子，并引入輔助基質(zhì)減少過(guò)分碎裂坞笙。一般采用固體基質(zhì)岩饼，基質(zhì)樣品比為10000/1。根據(jù)分析目的不同使用不同的基質(zhì)和波長(zhǎng)薛夜。
3）質(zhì)量分析器
質(zhì)量分析器是質(zhì)譜儀的核心籍茧，將帶電離子根據(jù)其質(zhì)荷比加以分離，以便用于紀(jì)錄各種離子的質(zhì)荷比和豐度信息梯澜。通常不同類型的質(zhì)量分析器組合會(huì)構(gòu)成不同功能的質(zhì)譜儀寞冯，這就是所謂的串聯(lián)質(zhì)譜。
目前最常用的質(zhì)量分析器有：A.四級(jí)桿（Quadrupole）晚伙；B. 飛行時(shí)間（time-of-flight,TOF）吮龄；C. 離子阱（ion trap）；D. 靜電場(chǎng)軌道阱（Orbitrap）咆疗。
飛行時(shí)間質(zhì)譜 (TOF)漓帚，分析物的質(zhì)荷比是根據(jù)分析物在真空飛行管中的飛行時(shí)間推算出的。飛行時(shí)間質(zhì)譜的質(zhì)量分析器由調(diào)制區(qū)午磁、加速區(qū)尝抖、無(wú)場(chǎng)飛行空間和檢測(cè)器等部分組成。通過(guò)離子源得到離子以后迅皇，離子經(jīng)過(guò)一個(gè)加速的區(qū)域昧辽，所有的離子都會(huì)獲得一個(gè)相同的初始動(dòng)能，然后它們進(jìn)入一個(gè)沒(méi)有電場(chǎng)的區(qū)域登颓，不同質(zhì)量的離子具有不同的能量奴迅，重的離子飛行速度會(huì)慢一些，輕的離子飛得快一些挺据，最終離子都會(huì)通過(guò)整個(gè)飛行區(qū)域，到達(dá)檢測(cè)器脖隶。飛行時(shí)間是與質(zhì)荷比的平方根成正比的扁耐，通過(guò)無(wú)場(chǎng)區(qū)的飛行時(shí)間長(zhǎng)短不同，離子可以依次被收集檢測(cè)出來(lái)产阱。這種質(zhì)量分析器結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單婉称、掃描速度快、靈敏度高、質(zhì)量范圍寬王暗。TOF質(zhì)譜儀的外表特點(diǎn)就是非常長(zhǎng)悔据，為了讓離子能夠盡可能跑得遠(yuǎn)一些。
四極桿 (Quadrupole, Q)由四根平行的棒狀電極組成而得名俗壹。四根電極分成兩組科汗，兩個(gè)相對(duì)的是一組，在相對(duì)的電極上加上一個(gè)相同的交流電壓和直流電壓绷雏，而在相鄰的電極上头滔，則加上相反的交流電壓和直流電壓，通過(guò)疊加交流電壓和直流電壓涎显，不同質(zhì)荷比的離子進(jìn)入四級(jí)桿以后坤检，會(huì)發(fā)生震蕩，然后飛行轉(zhuǎn)圈期吓，當(dāng)掃描的電壓和頻率一定的時(shí)候早歇，只有特定質(zhì)荷比的離子才能穿過(guò)四級(jí)桿。通過(guò)改變四級(jí)桿上的電壓讨勤，我們可以讓不同質(zhì)荷比的離子依次穿過(guò)質(zhì)譜儀箭跳，到達(dá)檢測(cè)器。而其它質(zhì)荷比的離子就會(huì)因?yàn)槠D(zhuǎn)太多悬襟，而打到四級(jí)桿上衅码，或者從縫隙里穿出。這種質(zhì)量分析器結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單脊岳、體積小逝段，僅用電場(chǎng)不用磁場(chǎng)，掃描速度快割捅，特別適合液相色譜聯(lián)機(jī)奶躯，分辨率不高，對(duì)高質(zhì)量離子有質(zhì)量歧視效應(yīng)亿驾。四級(jí)桿質(zhì)譜儀的外觀結(jié)構(gòu)比較緊湊嘹黔。
離子阱（ion trap）與四級(jí)桿原理類似，因此也稱四級(jí)離子阱莫瞬，它的橫截圖跟四級(jí)桿質(zhì)譜儀是一樣的儡蔓，只是它的側(cè)面開了一個(gè)洞，來(lái)作離子彈出用的疼邀。四級(jí)桿質(zhì)譜儀中喂江，離子是穿過(guò)質(zhì)譜儀飛出去的，而在離子阱質(zhì)譜儀中旁振，離子不會(huì)飛出質(zhì)譜儀获询，而是一直在阱里面涨岁，沿著下圖像8字型的軌跡飛行（阱指的就是陷阱，把離子包在里面一直轉(zhuǎn)圈）吉嚣。當(dāng)掃描電壓達(dá)到一定的數(shù)值以后梢薪，離子會(huì)被射出來(lái)。比四級(jí)桿靈敏度更高尝哆，質(zhì)量范圍大秉撇。離子阱分為線性離子阱和三維離子阱。線性離子阱具有更大的離子容量和掃描速度较解。也有人將靜電軌道離子阱（Orbitrap）歸并為離子阱的一類畜疾。
TOF只能檢測(cè)不同質(zhì)荷比的離子，卻不能選擇讓哪些離子留下印衔，而四級(jí)桿和離子阱既可以檢測(cè)離子啡捶，同時(shí)也可以實(shí)現(xiàn)離子的選擇，將想要的離子留在離子阱中奸焙，或者說(shuō)讓特定的離子穿過(guò)四級(jí)桿瞎暑。所以四級(jí)桿或離子阱又叫質(zhì)量過(guò)濾器，它可以過(guò)濾特定質(zhì)荷比的離子与帆。所以質(zhì)量分析器其實(shí)包括兩個(gè)部分了赌，即質(zhì)量過(guò)濾器和質(zhì)量檢測(cè)器。
Orbitrap的工作原理類似于電子圍繞原子核旋轉(zhuǎn)玄糟。由于靜電力作用勿她，離子受到來(lái)自中心紡錘形電極吸引力，由于離子進(jìn)入離子阱之前的初速度以及角度阵翎，離子會(huì)圍繞中心電極做圓周運(yùn)動(dòng)逢并。通過(guò)傅立葉變換(Fast Fourier Transform, FFT)，得到頻譜圖郭卫。因?yàn)楣舱耦l率和離子質(zhì)量的直接對(duì)應(yīng)關(guān)系砍聊，可以由此得到質(zhì)譜圖。
另外還有一類常用的是傅立葉變換離子回旋共振質(zhì)量分析器（FTICR）贰军，基于在強(qiáng)磁場(chǎng)中玻蝌，離子的回旋頻率與離子質(zhì)量成反比，所以測(cè)量離子的回旋頻率可以獲得其質(zhì)量词疼。它無(wú)需分離不同質(zhì)荷比的離子俯树，而是在同一時(shí)間內(nèi)同時(shí)測(cè)量所有離子的質(zhì)荷比和豐度，最大限度地利用全部離子的信息贰盗，所以分析靈敏度高聘萨。但是FTICR對(duì)真空度要求極高，同時(shí)強(qiáng)磁場(chǎng)需要龐大的超導(dǎo)磁鐵產(chǎn)生童太，所以成本很高。
FTICR和Orbitrap都是是基于離子在場(chǎng)中回旋運(yùn)動(dòng)，通過(guò)測(cè)定回旋共振頻率书释，并進(jìn)行傅里葉變換翘贮，來(lái)測(cè)定離子質(zhì)荷比，區(qū)別在于Orbitrap用的是電場(chǎng)爆惧，而FTICR用的是磁場(chǎng)狸页，所以O(shè)rbitrap性價(jià)比高，應(yīng)用更廣扯再。
4）檢測(cè)器
如電子倍增器芍耘、閃爍檢測(cè)器、法拉第杯熄阻、照相檢測(cè)等斋竞。
5）其他
除此之外，還包括真空系統(tǒng)秃殉，使離子可以穩(wěn)定地飛行坝初，不受其它空氣分子的干擾。計(jì)算機(jī)系統(tǒng)钾军，實(shí)現(xiàn)質(zhì)譜儀的控制和數(shù)據(jù)的采集鳄袍。氣體系統(tǒng)，氣體供應(yīng)和廢氣處理（氮?dú)饫艄А鍤猓┺中 ｋ娏?yīng)，UPS不間斷電源系統(tǒng)樱哼。
3. 質(zhì)譜儀參數(shù)
評(píng)估一臺(tái)質(zhì)譜儀的性能哀九，通常有以下指標(biāo)：
1）檢測(cè)限
與三倍噪音相當(dāng)?shù)奈镔|(zhì)的量，可以理解為這是質(zhì)譜儀能夠檢測(cè)到的最低含量化合物的濃度唇礁。通常會(huì)用利血平來(lái)作為一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的化合物測(cè)定質(zhì)譜儀的檢測(cè)限勾栗。
可以認(rèn)為，靈敏度與檢測(cè)限評(píng)估的是同一種性能盏筐。
2）線性范圍
表示在什么樣的濃度范圍之內(nèi)围俘，質(zhì)譜儀檢測(cè)到的信號(hào)與樣品濃度之間成線性的關(guān)系。也就是說(shuō)在這個(gè)濃度范圍內(nèi)的樣品用這臺(tái)質(zhì)譜儀檢測(cè)是比較合適的琢融，高于或低于這個(gè)濃度范圍的樣品界牡，需要濃縮或者稀釋后才能用這臺(tái)質(zhì)譜儀檢測(cè)。
一般質(zhì)譜儀的線性范圍在3-6個(gè)數(shù)量級(jí)漾抬，即1,000—1000,000范圍內(nèi)宿亡。而大部分質(zhì)譜儀在1000 – 10,000這個(gè)范圍內(nèi)。
這個(gè)參數(shù)的意義在于纳令，當(dāng)我們的樣品在一個(gè)比較寬的濃度范圍內(nèi)時(shí)挽荠，如果質(zhì)譜儀的線性范圍非常好克胳，就不需要濃縮低濃度的樣品，也不需要稀釋高濃度的樣品圈匆，可以直接進(jìn)樣漠另，這樣就可以大大減少樣品前處理的復(fù)雜程度，節(jié)省時(shí)間和實(shí)驗(yàn)步驟跃赚。
3）分辨率
即我們通常所說(shuō)的高分辨質(zhì)譜笆搓。
分辨率就是質(zhì)譜儀可以分辨最靠近的兩個(gè)質(zhì)譜峰的質(zhì)量差值。當(dāng)兩峰重疊部分的高度不超過(guò)任何一個(gè)質(zhì)譜峰峰高10%時(shí)纬傲，一般認(rèn)為這是兩個(gè)可分離的峰满败，測(cè)定其中任何一個(gè)質(zhì)譜峰的半峰寬（即峰高一半處的峰寬），然后用任何一個(gè)峰的質(zhì)荷比除以半峰寬叹括，就可以得到分辨率算墨。
目前高分辨質(zhì)譜儀的分辨率可以達(dá)到50,000-100,000的數(shù)量級(jí)，一般的四級(jí)桿可以達(dá)到5,000-10,000领猾。
上圖圈出的峰在低分辨率時(shí)只能觀察到一個(gè)峰（一個(gè)化合物）米同，隨著分辨率上升可以看出，這其實(shí)是兩個(gè)不同峰的峰摔竿，所以高分辨率能獲得更全面的化合物信息面粮。
4）質(zhì)量準(zhǔn)確度
指質(zhì)譜儀測(cè)到的質(zhì)荷比與它實(shí)際的質(zhì)荷比的差值，除以它真實(shí)的質(zhì)荷比與1,000,000的乘積继低。所以它是以ppm為單位的（百萬(wàn)分之一）熬苍，這個(gè)數(shù)值看起來(lái)更方便。目前高分辨質(zhì)譜儀質(zhì)量準(zhǔn)確度在2-5個(gè)ppm的范圍之內(nèi)袁翁。
質(zhì)量準(zhǔn)確度高柴底，可以大大減少候選化合物的數(shù)量，提高鑒定的成功率粱胜。
分辨率與質(zhì)量偏差分別評(píng)估了質(zhì)譜儀的精密度與準(zhǔn)確性柄驻，通常希望兩者都高。就像我們打靶焙压，比如打靶鸿脓，若每一次都打在不是靶點(diǎn)的同一個(gè)點(diǎn)，說(shuō)明精密度非常高涯曲，但準(zhǔn)確性卻比較差野哭；若每次打的點(diǎn)很分散，但平均起來(lái)的位置剛好在靶心幻件，則說(shuō)明質(zhì)量準(zhǔn)確性還可以拨黔，但精密度比較差。
目前我們能用到的高分辨質(zhì)譜儀绰沥，不管是QTOF或者Orbitrap系列篱蝇，都可以達(dá)到50,000以上的分辨率贺待，同時(shí)也可以達(dá)到2-3ppm的質(zhì)量準(zhǔn)確性。下圖是目前常用質(zhì)譜儀的重要參數(shù)比較：
對(duì)于蛋白質(zhì)組學(xué)研究來(lái)講态兴，我們對(duì)質(zhì)譜儀器性能的最低要求是：分辨率至少在40,000-50,000狠持，質(zhì)量準(zhǔn)確性應(yīng)該優(yōu)于5ppm，質(zhì)量掃描范圍應(yīng)該在100-3,000瞻润，掃描速度是每秒至少獲得一張高分辨的一級(jí)譜圖和十張高分辨的二級(jí)譜圖。
4. 串聯(lián)質(zhì)譜儀
串聯(lián)質(zhì)譜（MS/MS）就是將相同或者不同的質(zhì)譜儀串聯(lián)起來(lái)甜刻，實(shí)現(xiàn)串聯(lián)或者并聯(lián)工作绍撞。這樣做一是為了產(chǎn)生二級(jí)碎片離子，二是實(shí)現(xiàn)不同質(zhì)譜儀性能的優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)得院。
常見(jiàn)的串聯(lián)質(zhì)譜有：
三重四級(jí)桿（Triple Quadrupole）傻铣，或者串聯(lián)四級(jí)桿，就是把三個(gè)四級(jí)桿串聯(lián)起來(lái)祥绞，這樣做的主要目的是為了實(shí)現(xiàn)二級(jí)質(zhì)譜的掃描非洲。
四級(jí)桿和飛行時(shí)間質(zhì)譜儀串聯(lián)到一起，就是我們經(jīng)常聽(tīng)到的Q-TOF蜕径，它實(shí)際上是為了提高二級(jí)質(zhì)譜的分辨率两踏。
Orbitrap與四級(jí)桿/離子阱組合，比如Orbitrap Fusion兜喻，Orbitrap Elite等組合梦染。
下面，用三重四級(jí)桿的例子來(lái)說(shuō)明串聯(lián)質(zhì)譜儀是如何獲得二級(jí)碎片離子的朴皆。
第一個(gè)四級(jí)桿Q1開啟質(zhì)量選擇模式帕识，它讓特定質(zhì)荷比的離子穿過(guò)質(zhì)譜儀，而把其它的離子都甩掉（甩到四級(jí)桿上或者四級(jí)桿的空間當(dāng)中去）遂铡。當(dāng)特定的離子被選擇好后（稱為母離子肮疗，precursor ion），會(huì)進(jìn)入碰撞池Q2（collision cell扒接，用來(lái)碎裂離子）伪货。在碰撞池里通常入口電壓會(huì)高于出口電壓，當(dāng)母離子進(jìn)來(lái)以后珠增，通過(guò)電壓差的作用加速超歌，然后與碰撞池里的氦氣或氮?dú)夥肿影l(fā)生碰撞、碎裂蒂教，形成碎片離子（fragment ions巍举，也稱子離子）。最后凝垛，這些碎片離子進(jìn)入第三個(gè)四級(jí)桿Q3中進(jìn)行二級(jí)的掃描懊悯，得到二級(jí)質(zhì)譜圖蜓谋。
其他的串聯(lián)質(zhì)譜運(yùn)行大體是一樣的。
Q-TOF炭分，Bruker生產(chǎn)桃焕，Q1四級(jí)桿，Q2碰撞池捧毛，Q3飛行時(shí)間質(zhì)譜儀观堂。這里用了一個(gè)反射模式飛行（讓離子拐個(gè)彎再飛回來(lái)），讓離子在更短的空間內(nèi)可以飛得更遠(yuǎn)一些呀忧。
Orbitrap系列师痕，如Q Exactive質(zhì)譜儀，Q1也是一個(gè)四級(jí)桿而账，Q2是碰撞池胰坟，Q3是被一個(gè)Orbitrap所取代。
Orbitrap Elite泞辐，Q1離子阱笔横，Q2碰撞池，Q3為Orbitrap咐吼。
Orbitrap Fusion吹缔，Q1四級(jí)桿，Q2離子阱汽烦，Q3為Orbitrap涛菠，同時(shí)還有一個(gè)碰撞池，整體是一個(gè)非常復(fù)雜的結(jié)構(gòu)撇吞。它的特點(diǎn)是Orbitrap與離子阱可以同步進(jìn)行掃描（一般質(zhì)譜儀的兩個(gè)質(zhì)量檢測(cè)器是不能同時(shí)掃描的俗冻，只能一個(gè)做質(zhì)量檢測(cè)，一個(gè)做質(zhì)量過(guò)濾）牍颈，所以掃描速度會(huì)更快迄薄，性能也更好。Fusion的分辨率可達(dá)到240,000 – 960,000煮岁。
三讥蔽、蛋白質(zhì)組學(xué)的鑒定原理
蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定常用基于二維凝膠電泳和基于質(zhì)譜兩種方法。
1.基于二維凝膠分離 (2D-Gel)鑒定
這是傳統(tǒng)蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定方法画机。大致原理是2D-Gel根據(jù)蛋白的等電點(diǎn)和分子質(zhì)量的差異冶伞，通過(guò)等點(diǎn)聚焦和SDS-PAGE分離，通過(guò)染色和成像把不同電性和大小的蛋白質(zhì)顯示在凝膠上步氏。
具體來(lái)說(shuō)响禽，就是利用聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳的電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)，使之凝膠電泳遷移率與所帶的電荷多少以及分子大小都有關(guān)，電荷越多跑得越快芋类，分子越小跑得越快隆嗅。
這是蛋白質(zhì)組學(xué)濕實(shí)驗(yàn)常用鑒定方法，不是我們關(guān)注的重點(diǎn)侯繁。當(dāng)然在基于質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定前胖喳，也常常用這種方法來(lái)進(jìn)行分離預(yù)處理。
2.基于質(zhì)譜（MS）鑒定
1）鑒定大致流程
常規(guī)的蛋白質(zhì)譜鑒定路線有這么幾個(gè)步驟：
樣本制備：細(xì)胞贮竟、組織丽焊、血液；蛋白復(fù)合體咕别；特異修飾蛋白（如磷酸化粹懒、糖基化、泛素化等）顷级；
樣本分離：1-D gel；2-D gel确垫；LC（liquid chromatograph）弓颈；
質(zhì)譜分析：如MALDI-TOF、ESI-MS等删掀；
數(shù)據(jù)庫(kù)搜索：Sequest翔冀；Mascot；MaxQuant等披泪；
數(shù)據(jù)分析：R纤子、Linux、Perl款票、Python等控硼。
2）色譜分離
色譜/層析（chromatography）是一種分離復(fù)雜混合物中各個(gè)組分的有效方法。它是利用不同物質(zhì)在由固定相和流動(dòng)相構(gòu)成的體系中具有不同的分配系數(shù)艾少，攜帶樣品的流動(dòng)相穿過(guò)固定相時(shí)卡乾，由于樣品各組分理化性質(zhì)存在差異园蝠，與固定相作用力弱的組分栓辜，移動(dòng)速度快谒获；反之恶复，移動(dòng)速度慢彼妻。根據(jù)不同的保留時(shí)間弧械，收集特定屬性的樣品進(jìn)行進(jìn)一步分析铆农。色譜有多種丢习，可以按固定相類型和分離原理進(jìn)行分類雏吭，根據(jù)流動(dòng)相的不同可分為氣相色譜和液相色譜锁施。
根據(jù)相互作用類型的不同，色譜法可分為吸附色譜法：物理吸附法，分配色譜法沾谜，離子交換色譜法膊毁，尺寸排阻色譜法，親和色譜法等等基跑。目前婚温，在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，用得最多的就是分配色譜法媳否，就是根據(jù)樣品在固定相與流動(dòng)相之間溶解度的差異來(lái)實(shí)現(xiàn)多肽或蛋白的分離栅螟。實(shí)際上是利用了多肽或蛋白疏水性上的差異。
液相色譜儀主要由以下4個(gè)部分組成：
色譜柱：玻璃柱+固定相
流動(dòng)相輸送系統(tǒng)：色譜柱填料很細(xì)篱竭，只有一點(diǎn)幾微米到幾微米力图，需要用一個(gè)泵來(lái)把流動(dòng)相擠壓下去。所以液相色譜要配一個(gè)泵系統(tǒng)掺逼，來(lái)輸送流動(dòng)相吃媒。
進(jìn)樣系統(tǒng)：用密封的系統(tǒng)需要一個(gè)自動(dòng)進(jìn)樣器來(lái)完成。
檢測(cè)系統(tǒng)：現(xiàn)在常用的有紫外或熒光吕喘，最簡(jiǎn)單的就是用肉眼來(lái)觀察是否有樣品流出赘那。
上圖左邊是戴安的液相色譜儀，從上往下依次是泵系統(tǒng)氯质、進(jìn)樣系統(tǒng)募舟、柱系統(tǒng)和檢測(cè)系統(tǒng)，右邊是Waters的液相色譜儀闻察，也是類似的結(jié)構(gòu)拱礁。
對(duì)于蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域，常用的液相色譜儀是納升液相色譜辕漂，其特點(diǎn)是色譜柱細(xì)呢灶，流速慢，減少樣品被流動(dòng)相稀釋的倍數(shù)钮热，從而提高檢測(cè)的靈敏度填抬。
高效（高壓/高速）液相色譜（high performance liquid chromatography, HPLC）是目前很常用的一種液相色譜方法。其流動(dòng)相為液體隧期，在高壓作用下快速流過(guò)固定相飒责，分離效能高，靈敏度高仆潮，應(yīng)用范圍廣宏蛉，柱子可反復(fù)使用。最早洗脫出的是越親水的性置。
3）液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)
對(duì)于蛋白質(zhì)組學(xué)研究來(lái)說(shuō)拾并，液相色譜和質(zhì)譜是不能單獨(dú)工作的，它們必須聯(lián)機(jī)工作，才能實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)的檢測(cè)嗅义。
液相色譜儀是在常溫常壓下工作的屏歹，柱子是放在空氣中運(yùn)行的，而且樣品是溶解在流動(dòng)相（水或有機(jī)溶劑）當(dāng)中的之碗。而質(zhì)譜儀需要在真空環(huán)境下工作蝙眶，樣品需要從溶液狀態(tài)轉(zhuǎn)化為氣態(tài)，而且需要被電離褪那。所以總的來(lái)說(shuō)幽纷，我們需要一個(gè)電離源，能把樣品從常溫常壓的液相狀態(tài)直接變成真空中的氣態(tài)離子狀態(tài)博敬。
電離源要實(shí)現(xiàn)的功能有三個(gè)：一是去溶劑和氣化友浸，把樣品中的溶劑去掉，將待檢測(cè)的多肽分子變成多肽的氣態(tài)分子偏窝；二是將多肽的氣態(tài)分子離子化收恢，讓它們帶上電荷；三是把多肽的氣態(tài)離子送到真空當(dāng)中祭往。
電噴霧電離（ESI）實(shí)現(xiàn)了這些派诬，具體過(guò)程是這樣的：樣品首先通過(guò)一個(gè)毛細(xì)管噴針被噴出來(lái)，進(jìn)入質(zhì)譜儀链沼，而在噴針的外面，會(huì)用一個(gè)鞘氣（sheath gas）來(lái)輔助樣品的霧化沛鸵。對(duì)鞘氣進(jìn)行加熱括勺，當(dāng)加熱的鞘氣吹到樣品中或者溶液中時(shí)，溶液中的流動(dòng)相或者溶劑就會(huì)揮發(fā)曲掰，就會(huì)剩下氣態(tài)的離子疾捍。同時(shí)，在毛細(xì)管噴針尖端與質(zhì)譜儀的入口之間栏妖，還會(huì)加一個(gè)電壓乱豆，叫High voltage，對(duì)這些待電離的分子吊趾，首先溶劑揮發(fā)掉宛裕，然后分子被氣化，最后在電場(chǎng)的作用下论泛，分子就會(huì)變成離子揩尸，實(shí)現(xiàn)電離的過(guò)程。最后屁奏，這些離子會(huì)被質(zhì)譜儀入口處的真空抽到質(zhì)譜儀里岩榆，同時(shí)被電場(chǎng)驅(qū)動(dòng)進(jìn)入質(zhì)譜儀。于是，就實(shí)現(xiàn)了氣化勇边、電離以及真空過(guò)渡三重需求犹撒。這就是液相色譜與質(zhì)譜的接口，即ESI電噴霧電離粒褒。
簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)识颊，色譜用來(lái)分離化合物，質(zhì)譜用來(lái)分析純物質(zhì)的結(jié)構(gòu)怀浆。
3.蛋白質(zhì)組學(xué)分析策略
1) Bottom up
目前蛋白質(zhì)組學(xué)分析應(yīng)用最廣的方法谊囚。也是我們所說(shuō)的“鳥槍法（shotgun）”，此處的“bottom”指的是肽段执赡，“up”則是由肽段推理為蛋白的過(guò)程镰踏。即先將蛋白酶解成肽段，然后通過(guò)色譜分離肽段混合物沙合，再用質(zhì)譜技術(shù)將肽段碎裂奠伪，根據(jù)碎裂譜圖的離子峰信息進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)搜索來(lái)鑒定肽段，最后將鑒定的肽段進(jìn)行組裝首懈、重新歸并為蛋白绊率。
該方法技術(shù)發(fā)展成熟，相關(guān)的軟件工具及算法都比較多究履，適合分析復(fù)雜樣本滤否。缺點(diǎn)是蛋白序列覆蓋度不完整，據(jù)說(shuō)覆蓋度僅10%-20%最仑。這就導(dǎo)致氨基酸序列高度相似的蛋白質(zhì)變體（proteoform）推理不準(zhǔn)確藐俺，而且由于是逆向組裝蛋白，不適合進(jìn)行翻譯后修飾的檢測(cè)泥彤。
2) Top down
這里的“top”指的是完整蛋白質(zhì)分子的質(zhì)量測(cè)定欲芹，“down”則是指對(duì)完整蛋白的碎裂。無(wú)需酶解吟吝，通過(guò)完整蛋白質(zhì)的質(zhì)量及其碎裂譜圖信息可以實(shí)現(xiàn)真正意義上的蛋白質(zhì)鑒定菱父，序列覆蓋度高（號(hào)稱100%），能保留多種翻譯后修飾之間的關(guān)聯(lián)信息剑逃。但是該方法通量較低浙宜，不適合分析復(fù)雜樣本，在完整蛋白質(zhì)分離蛹磺、質(zhì)譜分析梆奈、生物信息學(xué)等各方面的技術(shù)相對(duì)也不完善。
蛋白質(zhì)譜原理暫時(shí)介紹到這里称开，主要還是介紹質(zhì)譜儀的相關(guān)常識(shí)亩钟，下篇筆記將重點(diǎn)介紹基于串聯(lián)質(zhì)譜以及bottom up方法的蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定分析流程乓梨。
Ref:
ps:文中部分圖片來(lái)自來(lái)自中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)生物學(xué)院的李溱老師
http://www.crickcollege.com/news/179.html
http://www.crickcollege.com/news/220.html
http://www.crickcollege.com/news/222.html
http://www.crickcollege.com/news/233.html
https://wenku.baidu.com/view/d881c10502020740be1e9bad.html
https://wenku.baidu.com/view/85e9bbe9a5e9856a571260a0.html
