一、數(shù)據(jù)準備
1、Mapping文件
Mapping文件為描述測序樣本信息的文件星立，“數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)”，文件格式為.txt葬凳，需手動建立绰垂，其基本格式如下：
其中前三列與最后一列為必備列，分別為樣品名火焰，Barcode序列劲装，引物序列，以及樣品描述信息荐健，其余列可自行添加用于樣品分組酱畅。
準備好的Mapping文件需使用validate_mapping_file.py檢驗其正確性：
validate_mapping_file.py -m Fasting_Map.txt -o validate_mapping_file_output
2、測序結(jié)果文件
一般情況下江场，我們得到的是測序公司提供的已分割好的數(shù)據(jù)纺酸，測序公司會提供已拼接完成的.fastq格式文件，每個樣品單獨一個文件址否。
將測序文件單獨放在某一文件夾下餐蔬，進行初步的質(zhì)控、文件合并以及格式整理以用作下一步分析佑附，該步驟通過multiple_split_libraries_fastq.py命令實現(xiàn)樊诺。
multiple_split_libraries_fastq.py -i input_files -o output_folder --demultiplexing_method sampleid_by_file --read_indicator _R1_ --sampleid_indicator _
其中--read_indicator參數(shù)為序列文件名中代表性的特征字符，用于區(qū)分該文件夾下其他文件音同；--sampleid_indicator參數(shù)為序列文件名中某一字符词爬，其用途為該字符前面的字符將作為后續(xù)分析的樣品ID，例如sample1_L001_R1_001.fastq.gz权均，_R1_為表征該文件為序列文件的特征字符顿膨， _之前的sample1作為該文件對應樣品的樣品ID。
該步驟運行結(jié)果可得到一個.fasta格式文件叽赊，包含所有樣品所有序列恋沃，其序列名基本格式為
><sample_id>_<unique_seq_id>
二、OTU劃分
可以利用上步得到的.fasta格式文件直接劃分OTU必指，可使用pick_de_novo_otus.py命令：
pick_de_novo_otus.py -i $PWD/seqs.fna -o $PWD/uclust_otus/
該命令為一workflow囊咏，具體包含以下7條命令：
1、pick_otus.py
pick_otus.py -i seqs.fasta -o picked_otus_defaul
第一步為OTU劃分塔橡，-m參數(shù)設置劃分方法梅割，默認采用uclust方法，-s設置相似度閾值谱邪，默認值為0.97炮捧。該步驟所得結(jié)果文件為：seqs_otus.txt與seqs_otus.log文件。seqs_otus.log為日志文件惦银，記錄相關(guān)參數(shù)咆课，seqs_otus.txt文件每行包含OTU_ID以及該OTU下包含的序列名，基本格式如下：
2扯俱、pick_rep_set.py
pick_rep_set.py -i seqs_otus.txt -f seqs.fasta -o rep_set1.fasta
第二步為挑選出每個OTU的代表序列书蚪，所有OTU均有一條代表序列，合并為一個文件迅栅，序列名為>OTU_ID sequence_ID文件基本形式如下：
3殊校、align_seqs.py
align_seqs.py -i $PWD/unaligned.fna -t $PWD/core_set_aligned.fasta.imputed -o $PWD/pynast_aligned_defaults/
第三步是對上一步得到的代表序列進行對齊操作（Alignment），得到一個已對齊的.fasta文件读存，-m參數(shù)設置方法为流，默認方法為PyNAST呕屎。
4、assign_taxonomy.py
assign_taxonomy.py -i repr_set_seqs.fasta -r ref_seq_set.fna -t id_to_taxonomy.txt
第四步是進化分類敬察，根據(jù)上步得到的代表序列秀睛，確定每個OTU的進化分類，-m參數(shù)設置方法莲祸，默認采用uclust consensus taxonomy assigner 蹂安，也可以設置采用RDP方法進行分類。該步可得到一log文件和Assignment文件锐帜，其形式如下：
5田盈、filter_alignment.py
filter_alignment.py -i seqs_rep_set_aligned.fasta -o filtered_alignment/
第五步是對第三步得到的Alignment文件進行剪切，去掉alignment序列中的空格（Gaps)缴阎，用于下一步構(gòu)建進化樹允瞧。
6、make_phylogeny.py
make_phylogeny.py -i $PWD/aligned.fasta -o $PWD/rep_phylo.tre
利用上步得到的文件構(gòu)建進化樹蛮拔，-m參數(shù)設置建樹方法瓷式，默認采用fasttree。
7语泽、make_otu_table.py
make_otu_table.py -i otu_map.txt -t tax_assignments.txt -o otu_table.biom
最后一步是生成.biom格式的OTU table贸典，OTU table每一列為一樣品，每一行為一OTU以及該OTU在各樣品中出現(xiàn)的次數(shù)踱卵。輸入文件為第一步得到的文件廊驼。
由于在下一步驟中還需進行質(zhì)量控制，所以主要用于下游統(tǒng)計分析的第5惋砂、6兩步可以暫時跳過妒挎。
