最近幾期的文章介紹了一些輔助分子克隆實驗的小工具筏餐，雖然功能很簡單莺治，還是費了很大功夫編寫，最近確實很忙酌畜，不過趁周末終于把他們肝完了怎囚，本篇就對這些小工具做一個匯總，以暫時結(jié)束本系列。
這套工具包括八個子工具恳守，共16個功能模塊考婴，近5000行代碼，主要用于輔助分子克隆實驗設(shè)計催烘，希望能對你有所幫助沥阱。
工具集網(wǎng)址：http://liuzhen106.com/tools/
1 引物設(shè)計
PCR是現(xiàn)代分子生物學領(lǐng)域應(yīng)用最普遍、最成熟的技術(shù)（沒有之一）伊群，具有很強的穩(wěn)健型考杉，因此實踐中似乎怎么隨意的設(shè)計引物都能擴增成功，大多數(shù)情況下也確實如此舰始。但是崇棠，3’錯配、極不對稱的Tm也可能導致PCR失敗丸卷，尤其是使用復(fù)雜DNA模板時枕稀，精心設(shè)計的引物能夠提高PCR擴增的成功率。
引物設(shè)計是本套工具集中最核心的工具谜嫉，包括4個功能模塊：克隆PCR萎坷、巢式PCR、qPCR(SYBR)骄恶、qPCR(Taqman)食铐。設(shè)計原理我在之前的文章《PCR引物設(shè)計大法》中有詳細介紹，主要考慮Tm僧鲁、GC%虐呻、3’端錯配，3’末端堿基種類等因素寞秃，構(gòu)建一個評分函數(shù)斟叼，根據(jù)得分篩選出最佳引物對。程序化設(shè)計使得窮舉大量引物成為可能春寿，相當于把所有的引物組合都拉出來分析一下朗涩，這樣就能夠篩選出最佳的引物，因此本工具還是十分有實用價值的绑改。下面分模塊介紹一下他們的特點：
- 克隆PCR
由于必須擴增基因全長序列谢床，就在序列的開頭和末尾把所有18-30bp的引物拉出來，根據(jù)?Tm < 3℃這一原則厘线，選出得分最高的引物對识腿。如果基因內(nèi)部存在重復(fù)結(jié)構(gòu)，程序自動示警但也就不再繼續(xù)設(shè)計引物造壮。在本模塊中你可以正反向引物5’末端添加酶切位點渡讼，然后用于后繼的酶切連接，引物以表格方式輸出，點擊復(fù)制按鈕可以自動復(fù)制引物序列成箫。
- 巢式PCR
巢式PCR是一種提高產(chǎn)物特異性的PCR方法展箱，包括兩輪PCR，第一輪在目標基因之外進行擴增蹬昌，然后從擴增產(chǎn)物中擴增目標基因混驰。一般適用于目標基因前后GC%不平衡的序列（如植物中的有些啟動子），與其他基因存在同源性的基因等皂贩。使用該模塊時账胧，需要同時提供目標基因和一個更大的模板序列，輸出外圍PCR引物和目標基因的克隆引物先紫。
- qPCR(SYBR)
依賴于SYBR染料的qPCR治泥，使用方便、通用性強遮精、價格不高居夹，大眾最愛。這種不需要設(shè)計額外的引物本冲，但由于SYBR可以與所有dsDNA結(jié)合准脂，容易受非特異性條帶干擾，設(shè)計引物時應(yīng)盡可能考慮特異性檬洞，推薦使用NCBI的PrimerBlast工具狸膏，它可以在基因組范圍內(nèi)分析引物的特異性。本模塊未提供該功能添怔，只能在輸入的模板序列中尋找特異性最高的引物湾戳，一般輸出200-500bp的靶標基因的引物，這是qPCR(SYBR)最普遍的長度广料，如果不能滿足你的長度要求砾脑，可以使用“克隆PCR”模塊代替。
- qPCR(Taqman)
qPCR(Taqman)除了上下游引物外艾杏，還需要一條探針序列韧衣，探針設(shè)計有特殊的要求俭茧，比如5’端第一堿基不能是G慕爬，Tm要比上下游引物高8-10℃，3’端不能連續(xù)4個G兵琳，探針應(yīng)盡可能靠近上游引物等勃蜘。本模塊優(yōu)先設(shè)計探針硕噩，再根據(jù)探針的位置設(shè)計上下游引物，可以選擇探針兩端的熒光標記元旬，如果選擇MGB標記榴徐，探針Tm會比上下游低5-10℃（MGB具有化學上提高探針特異性的作用）。
2 引物Tm計算
這個工具用于計算DNA引物的退火溫度匀归，傳統(tǒng)的Tm = 2×(A+T)+4×(C+G)公式具有歷史局限性坑资，大量統(tǒng)計學研究已經(jīng)得到了更準確的Tm預(yù)測公式，詳情可查看之前的《PCR退火溫度預(yù)測》穆端。
3 核酸?蛋白
核酸與蛋白質(zhì)序列互轉(zhuǎn)工具袱贮，分為兩個模塊：核酸→蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)→核酸体啰。核酸→蛋白質(zhì)模塊提供將DNA序列翻譯成蛋白質(zhì)序列的功能攒巍，還提供核酸序列的密碼子分析（針對大腸桿菌宿主）。蛋白質(zhì)→核酸模塊將蛋白質(zhì)序列轉(zhuǎn)化為核酸序列荒勇，該步驟還提供密碼子優(yōu)化功能柒莉，此外該模塊可以直接分析蛋白質(zhì)序列的理論分子量、等電點和疏水性沽翔。
4 全基因合成
全基因合成是本套工具集中另一個比較核心的工具兢孝，其特點是利用59bp以內(nèi)（普通引物合成的最大長度）的引物基于重疊延伸PCR獲得木目標基因全長。按照引物搭橋的方式不同分為兩個模塊仅偎，“一正一反”和“一正多反”跨蟹，點擊標題欄的“+”按鈕，可以查看對應(yīng)方法的原理橘沥。該工具主要是省去人工一條一條去拉引物和計算重疊區(qū)的麻煩窗轩，程序保證所有引物間重疊區(qū)的Tm基本一致，這有利于各引物間均勻退火座咆。輸出的引物可以直接導入SnapGene軟件進行復(fù)核痢艺，詳細的設(shè)計原理及使用方法可以查看之前的《全基因合成方法》。
5 傳統(tǒng)克隆
適用于傳統(tǒng)的酶切連接克隆介陶，可以選擇單酶切和雙酶切的方式腹备，工具提供插入基因的內(nèi)部酶切位點分析和引物設(shè)計，還提供重組質(zhì)粒的完整序列生成斤蔓，可以導入SnapGene進行復(fù)核植酥。該工具允許添加一些標簽，其中內(nèi)置的是一些常用的純化及檢測標簽弦牡，他們是可以修改的友驮，你可以換成自己的標簽。
6 Golden Gate克隆
TypeIIS型內(nèi)切酶切割位點在識別位點之外驾锰，因此酶切后識別位點丟失卸留，新插入的片段不會被重新切除，使用TypeIIS型內(nèi)切酶的克隆方式稱為Golden Gate克隆椭豫。同傳統(tǒng)克隆相比耻瑟，可以酶切連接同時進行旨指，它即省去了DNA純化回收的麻煩，還簡化了實驗步驟喳整，是一種比較受歡迎的克隆方式谆构。TypeIIS存在許多同尾酶，命名多樣框都，但適合用于Golden Gate克隆主要有六種：AarI搬素、BbsI/BpiI、BspMI/BveI魏保、Eco31I/BsaI熬尺、Esp3I/BsmBI、SapI/LguI谓罗，本工具支持這六種內(nèi)切酶粱哼。生成插入片段的克隆引物時，成有優(yōu)先使用切割載體的內(nèi)切酶檩咱，如果基因內(nèi)部有該酶切位點皂吮，程序會自動選擇其他酶切位點，如果你不想使用程序選擇的酶切位點税手，你可以在序列內(nèi)部插入該位點蜂筹，再次生成引物程序會越過該位點使用下一個內(nèi)切酶。但要注意生成的重組載體序列也會包含認為插入的堿基芦倒，你可以在SnapGene中將其去除艺挪。
7 簡易克隆
Gibson克隆是Gibson等2009年正式公布的一種DNA組裝方法，一次性可連入多個片段兵扬，操作簡單麻裳，目前已經(jīng)十分流行。本工具針對這種克隆方法提供輔助設(shè)計器钟，根據(jù)線性化載體的方式分為酶切線性化和PCR擴增線性化津坑，外加一個DNA用量計算模塊。
- 限制性酶切線性化
Gibson克隆一般包括：線性載體制備傲霸，插入片段制備和片段重組疆瑰。本模塊適用于單酶切或雙酶切的方式進行載體線性化，查看內(nèi)切酶按鈕可輸出載體序列中的限制酶位點及數(shù)量昙啄，選擇對應(yīng)的限制酶進行酶切即可得到線性載體穆役。允許插入1-5個插入片段，可以選擇同源臂的長度梳凛，該長度是對所有片段通用的耿币。
- PCR擴增線性化
該模塊適用于利用PCR擴增的方式獲得線性載體，需要指定插入位點上下游的DNA序列（用于插入片段的位置定位）韧拒，PCR擴增務(wù)必使用高保真酶淹接。
- DNA用量計算
一般十性，載體與插入片段的摩爾比應(yīng)該為1:2-1:3，插入片段之間應(yīng)該為1:1塑悼。當插入片段<200bp時劲适，應(yīng)該顯著增加插入片段的用量1:8-1:10。本模塊將摩爾比換算成納克數(shù)拢肆，有利于配置重組體系的計算。
8 定點突變
本工具適用于編碼基因的氨基酸突變靖诗，根據(jù)是否使用新的載體分為使用舊載體和使用新載體兩個模塊郭怪。設(shè)計原理為根據(jù)輸入的突變位點，自動將野生型密碼子替換為突變密碼子刊橘，突變密碼子選用大腸桿菌使用頻率最高的同義密碼子鄙才。通過突變引物和PCR擴增合成攜帶突變基因局部片段，片段間存在同源區(qū)（同源區(qū)長度按Tm=52℃來自動控制促绵，這有利于重組反應(yīng)的退火平衡）攒庵，可以通過同源重組將突變片段一次性連入載體（相當于多片段Gibson克隆，適用于5個以內(nèi)的突變片段）败晴，也可以通過重疊延伸PCR獲得突變體全長序列后連入載體（相當于單片段Gibson克隆浓冒，適用于5個以上的突變片段）。
