最近聽了一個講座，里面提到了一些對于我來說比較陌生的技術(shù)：CROP-seq、CRISP-seq偷线、Perturb-seq飘弧。（雖然這些技術(shù)早在2017年就發(fā)表了）于是就查閱了文獻(xiàn)久信，看看這些都是些啥技術(shù)。這篇文章就先來學(xué)習(xí)CROP-seq链韭。這里我只是記錄了文獻(xiàn)里的一部分內(nèi)容陪白，主要是作者如何構(gòu)建的系統(tǒng)，對于他們后續(xù)的驗(yàn)證我這里只是記錄了一小部分硬纤。
學(xué)習(xí)的文獻(xiàn)是：Pooled CRISPR screening with single-cell transcriptome readout
在整個細(xì)胞群里進(jìn)行CRISPR篩選已經(jīng)被廣泛的使用于例如細(xì)胞增殖解滓、藥物抗性，和病毒感染等生物過程的基因鑒定筝家。將guide-RNA文庫轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞里洼裤，之后進(jìn)行篩選（圖1A）。那么這樣一來溪王，gRNA的分布就可以根據(jù)細(xì)胞的數(shù)量來判斷腮鞍。（這里我的理解是：如果gRNA靶向一個基因以后，細(xì)胞無法再增殖莹菱，甚至死亡移国，那么我們就可以認(rèn)為這個被靶向的基因是維持細(xì)胞增殖的，或者是survive必需的基因）細(xì)胞群的CRISPR篩選可以很好的用于那些影響細(xì)胞存活和增殖的機(jī)制研究道伟。然而迹缀，這個技術(shù)不支持復(fù)雜的分子readout，例如它不能揭示復(fù)雜蜜徽、富有信息量的轉(zhuǎn)錄譜祝懂。
Arrayed CRISPR篩選，一次只能進(jìn)行一個基因的靶向拘鞋，但這個技術(shù)是可以用RNA-seq作為readout的砚蓬。這個技術(shù)的缺點(diǎn)是由于費(fèi)用非常高，并且通量很低掐禁，需要人工的把單個細(xì)胞分離（圖1B）怜械。
這里我們提出了一個互補(bǔ)的篩選范例傅事，單細(xì)胞的CRISPR篩選缕允，檢測每一個單細(xì)胞的gRNA和該細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組（圖1C）。
為了實(shí)施這個想法障本，作者將CROP-seq方法結(jié)合了4個主要成分：（1）一個gRNA載體，這個載體使得每一個獨(dú)立的gRNA可以在單細(xì)胞RNA-seq實(shí)驗(yàn)中被檢測到。（2）單細(xì)胞RNA-seq的高通量分析驾霜。（3）a computational pipeline for assigning single-cell transcriptomes to gRNAs（不知道怎么翻譯才準(zhǔn)確）（4）生信方法分析并解釋gRNA誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄譜案训。CROP-seq提供了一種可擴(kuò)展的解析復(fù)雜的信號通路和其他生物機(jī)制的方法（圖1d）。
（1）從單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)里直接檢測gRNA
CRISPR gRNA通常由RNA聚合酶III從human的U6啟動子進(jìn)行轉(zhuǎn)錄粪糙。它們?nèi)狈olyA尾巴强霎，所以用現(xiàn)有的單細(xì)胞RNA-seq實(shí)驗(yàn)室沒有辦法檢測到的。所以作者將現(xiàn)有的CRISPR庫篩選載體(LentiGuide-Puro)進(jìn)行了改裝蓉冈，將gRNA包括在polyA的mRNA轉(zhuǎn)錄本里（圖1e）城舞。
由于經(jīng)典的LentiGuide-Puro是來源于一個lenti病毒載體煌茴，這個載體通過400bp關(guān)鍵啟動子元件的deletion進(jìn)行自我失活。作者假設(shè)在3'端的LTR區(qū)可以兼容一個hU6-gRNA的cassette大小的插入昧狮。在這個區(qū)域景馁，gRNA變成了具有puro抗性的mRNA的一部分，這個mRNA被RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄逗鸣，并且可以利用polyA富集的方法進(jìn)行RNA-seq。具有功能的gRNA繼續(xù)由hU6啟動子促進(jìn)表達(dá)绰精，另外撒璧，完整的hU6-gRNA的cassette在反轉(zhuǎn)錄的過程中可以被拷貝進(jìn)5'LTR，隨之整合進(jìn)病毒中笨使。因此CROP-seq方法解決了在單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組水平上對gRNA的檢測的問題卿樱，使得該方法可以把多種單細(xì)胞RNA-seq分析和大批量的篩選gRNA庫兼容在一起。
那么作者是怎么重新構(gòu)建的這個載體呢硫椰？
首先作者用PCR方法擴(kuò)增了質(zhì)粒的4個部分繁调，然后重新組裝了質(zhì)粒（Sup Fig1）。這個hU6-gRNA在3? LTR的插入不會影響病毒顆粒的形成靶草，也不會影響puro的抗性蹄胰。
作者用LentiGuide-Puro和CROPseq-GuidePuro兩種質(zhì)粒包病毒，檢測了這兩個載體的效果。他們分別在兩個質(zhì)粒上連接了3個驗(yàn)證的gRNA宾袜，分別靶向DNMT3B, MBD1, 和 TET2捻艳。還另外連接了一個更長的有可能影響病毒活性的結(jié)構(gòu)，然后比較這些病毒的滴度（圖1f）庆猫。
基因組編輯效率利用幾種表達(dá)cas9的細(xì)胞系（K562, Jurkat, and two HEK293T clones）來作為基準(zhǔn)進(jìn)行驗(yàn)證认轨。作者用了兩個gRNA來同時進(jìn)行驗(yàn)證（圖1g）≡屡啵基因組編輯在兩個載體里的效率都非常高嘁字，平均可以達(dá)到95.5% (LentiGuide-Puro)和90.5%(CROPseq-Guide-Puro)。靶向2個基因的編輯特點(diǎn)也在兩種載體里非常相似节视。
接下來作者檢測了單細(xì)胞RNA-seq是否能檢測到gRNA（CROPseq-Guide-Puro載體）（圖1h）拳锚。他們構(gòu)建了3個knock-out細(xì)胞系，gRNA分別靶向DNMT3B, MBD1, 和TET2寻行，然后將gRNA分別轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞霍掺，確保每一個細(xì)胞里都有特異的gRNA。當(dāng)使用CROP-seq把三種細(xì)胞系按照1：1：1的比例混在一起的時候拌蜘，單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的結(jié)果顯示在gRNA上有很高的測序覆蓋率杆烁。
結(jié)合所有的CROP-seq的結(jié)果，作者評估了gRNA的分配置信度（圖1i）简卧，這個值取決于每個細(xì)胞檢測到的基因數(shù)量兔魂。例如，如果每個細(xì)胞檢測500個基因举娩，置信度是38.7%析校，如果每個細(xì)胞檢測4000個基因，那么置信度是78.9%铜涉。
（2）單細(xì)胞CRISPR篩選t細(xì)胞受體誘導(dǎo)
之后作者利用了他們構(gòu)建的系統(tǒng)智玻，檢測了Jurkat細(xì)胞里T細(xì)胞受體的活性。作者設(shè)計了一個gRNA庫芙代，靶向6個高水平的T細(xì)胞受體的調(diào)節(jié)分子信號通路吊奢，和23個轉(zhuǎn)錄因子，每個基因設(shè)計了3個不同的gRNA纹烹。作者還同時設(shè)計了20個不靶向于任何基因的陰性對照页滚、9個重要基因的gRNA作為陽性對照。Jurkat細(xì)胞轉(zhuǎn)染cas9構(gòu)建為穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系铺呵，然后用CROPseq-Guide-Puro gRNA庫去感染細(xì)胞裹驰，puro篩選。之后用CD3或者CD28抗體激活TCR陪蜻，進(jìn)行CROP-seq分析（圖2a）邦马。通過測序質(zhì)粒文庫，比較gRNA的分布。作者發(fā)現(xiàn)陽性對照的敲除效果很好滋将，確定了CROP-seq的載體的效率很高（圖2b）邻悬。而針對TCR信號通路設(shè)計的gRNA靶向效率有明顯的差異，靶向ETS1,RUNX1,和GATA3 的gRNA敲除效率很好随闽，說明這些轉(zhuǎn)錄因子對于Jurkat細(xì)胞是比較重要的父丰。相反，其他的gRNA效率和陰性對照差不多掘宪，說明這些沒有抑制增殖的作用蛾扇。
作者對TCR誘導(dǎo)的單細(xì)胞RNA-seq轉(zhuǎn)錄譜（CROP-seq）進(jìn)行了降維分析（圖supp Fig 6a-c），根據(jù)gRNA靶向的基因進(jìn)行分組的主成分分析顯示魏滚，細(xì)胞群可以被分為na?ve和TCR誘導(dǎo)兩組镀首。
當(dāng)然作者還進(jìn)行了很多的后續(xù)驗(yàn)證部分，我就沒有放上來鼠次，總體來說更哄，作者是把單細(xì)胞測序和CRISPR篩選結(jié)合在了一起。作者在文章結(jié)尾處寫到腥寇，在他們的文章審稿的時候成翩，另外兩種技術(shù)Perturb-seq 和 CRISP-seq也發(fā)表了出來。這兩種技術(shù)是利用了barcode來進(jìn)行單細(xì)胞的CRISPR篩選赦役。和這兩種方法比起來麻敌，CROP-seq有一個很關(guān)鍵的優(yōu)勢就是它可以直接讀取gRNA，大大簡化了gRNA文庫的單細(xì)胞CRISPR篩選掂摔。
