注：mural細(xì)胞关霸，翻譯成“壁細(xì)胞”催首，但與本視頻中“B細(xì)胞”
發(fā)音相近，特此用mural細(xì)胞，以示與“B細(xì)胞”的區(qū)別

作者首先分析了2364個(gè)人前額葉皮層來(lái)的單細(xì)胞RNA測(cè)序數(shù)據(jù)窒舟，把這些數(shù)據(jù)做了聚類(lèi)

在聚類(lèi)后的數(shù)據(jù)中，排除掉了神經(jīng)性的細(xì)胞沿癞、神經(jīng)前體細(xì)胞躁绸、和紅細(xì)胞

剩下的細(xì)胞簇，再做UMAP圖枷莉，分成星型細(xì)胞娇昙、淋巴細(xì)胞、微膠質(zhì)細(xì)胞笤妙、少突膠質(zhì)細(xì)胞冒掌、周細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞

區(qū)分這些細(xì)胞噪裕，都是通過(guò)一系列經(jīng)典的marker基因的表達(dá)來(lái)做的

作者驚奇地發(fā)現(xiàn)，有一小部分細(xì)胞股毫，這些細(xì)胞同時(shí)表達(dá)CD19膳音，和mural細(xì)胞的marker基因CD248

但這些細(xì)胞不表達(dá)B細(xì)胞的marker基因CD79A

這說(shuō)明，在大腦里皇拣，是有表達(dá)CD19基因的細(xì)胞的严蓖。而且這些細(xì)胞不表達(dá)B細(xì)胞的marker基因CD79A

說(shuō)明這些細(xì)胞既不是B細(xì)胞，也不是混合有B細(xì)胞的雙細(xì)胞氧急。

作者進(jìn)一步觀察到這些細(xì)胞還表達(dá)CD81基因颗胡，而CD81蛋白是CD19的伴侶蛋白

CD19本身是一個(gè)跨細(xì)胞膜的蛋白，它需要CD81蛋白的幫助吩坝，來(lái)完成跨膜動(dòng)作

作者還在細(xì)胞簇的表達(dá)中毒姨，看到了淋巴細(xì)胞簇，淋巴細(xì)胞簇表達(dá)CD3钉寝、CD7弧呐、IL2RG等marker基因

而周細(xì)胞表達(dá)的基因，與淋巴細(xì)胞簇表達(dá)的基因嵌纲，是互斥的

這個(gè)進(jìn)一步說(shuō)明了俘枫，在大腦中表達(dá)CD19的細(xì)胞，不是淋巴細(xì)胞逮走，而是周細(xì)胞

這是對(duì)周細(xì)胞中CD19表達(dá)水平的分析

CD19基因的表達(dá)量鸠蚪，在周細(xì)胞的所有基因的表達(dá)量中排序，排到前86%的位置

同時(shí)师溅，可以看到周細(xì)胞中其它幾個(gè)marker基因的表達(dá)水平茅信，CD248是前85%，RGS5是前96%墓臭，

PDFGFRB是前97%

也就是說(shuō)蘸鲸，在周細(xì)胞中，CD19的表達(dá)水平是較高的

作者找了更多的數(shù)據(jù)集來(lái)進(jìn)行分析

在一個(gè)人類(lèi)前腦的數(shù)據(jù)集中窿锉，mural細(xì)胞是表達(dá)CD19的酌摇，但不表達(dá)CD79A

作者在第三個(gè)數(shù)據(jù)集中，進(jìn)一步做分析榆综，

在周細(xì)胞中妙痹，有較多細(xì)胞是表達(dá)CD19的，但這些細(xì)胞不表達(dá)B細(xì)胞的marker基因CD79A

在內(nèi)皮細(xì)胞中鼻疮，有少量細(xì)胞是表達(dá)CD19的怯伊，但這些內(nèi)皮細(xì)胞都不表達(dá)CD79A

在La Manno的兩個(gè)數(shù)據(jù)集中，周細(xì)胞中的CD19表達(dá)量，分別是所有基因排名的前86%耿芹，和前71%

這也說(shuō)明CD19在mural細(xì)胞中崭篡、周細(xì)胞中的表達(dá)水平是較高的

為了評(píng)估在人腦mural細(xì)胞中的CD19的表達(dá)，作者做了免疫組化吧秕。

樣本來(lái)自健康死亡的人琉闪，我估計(jì)是死于車(chē)禍之類(lèi)的人的大腦

用的抗體的編號(hào)是BT51E。這個(gè)抗體是識(shí)別CD19蛋白的C末端的砸彬，C末端是位于細(xì)胞質(zhì)這一面的

免疫組化的結(jié)果可以看圖颠毙，圖中在：海馬、島突砂碉、顳葉蛀蜜、腦橋、額葉增蹭、枕葉滴某、頂葉等位置，都發(fā)現(xiàn)了有染色

也就是圖中用黑色箭頭標(biāo)的這些位置

也就是說(shuō)在大腦的各個(gè)位置都有CD19的表達(dá)

為進(jìn)一步分析大腦在各個(gè)發(fā)育時(shí)期的CD19的表達(dá)滋迈，

作者找到了BICCN的數(shù)據(jù)集

BICCN數(shù)據(jù)集是BRAIN initiative Cell Census Network的縮寫(xiě)

作者找了來(lái)自101個(gè)樣本85萬(wàn)7千個(gè)細(xì)胞的數(shù)據(jù)霎奢，這些樣本都是不同發(fā)育時(shí)期的胚胎人類(lèi)大腦

作者把這85萬(wàn)個(gè)細(xì)胞的數(shù)據(jù)做了整合，整合出了885個(gè)元細(xì)胞

接著饼灿，對(duì)這些元細(xì)胞做聚類(lèi)分析幕侠，得到UMAP圖

這張UMAP圖是按元細(xì)胞的胎齡來(lái)標(biāo)的顏色，顏色越深碍彭，胎齡越大

這是按轉(zhuǎn)錄組相似性分出來(lái)的細(xì)胞簇橙依，不同的簇用不同的顏色進(jìn)行標(biāo)示

在元細(xì)胞中，我們可以清楚地看到硕旗，有CD19的表達(dá)。

同時(shí)女责，我們可以看到漆枚，這些元細(xì)胞中，有未分化的祖細(xì)胞marker基因PAX3的表達(dá)

和周細(xì)胞的幾個(gè)marker基因的平均表達(dá)水平

可以看到在mural元細(xì)胞簇中抵知，周細(xì)胞marker基因特異性高表達(dá)

也就是CD248這些基因在第6號(hào)的元細(xì)胞簇中特異性地高表達(dá)

在這張圖中墙基，橫座標(biāo)是周細(xì)胞marker基因的表達(dá)水平，縱座標(biāo)是CD19基因的表達(dá)水平

我們看到刷喜，CD19基因的表達(dá)水平残制，和周細(xì)胞marker基因的表達(dá)水平，有強(qiáng)相關(guān)性

作者還發(fā)現(xiàn)掖疮，在小膠質(zhì)細(xì)胞簇中初茶，CD19低表達(dá)

這三張圖，分別是三類(lèi)基因在胚胎各個(gè)階段的表達(dá)情況

從上到下浊闪，胚胎的胎齡越來(lái)越大恼布，

每個(gè)小柱子的高度螺戳，表示有多少個(gè)元細(xì)胞表達(dá)這個(gè)標(biāo)志基因

可以看到，胎齡15周之前折汞，沒(méi)有觀察到CD19的表達(dá)

并且倔幼，在這些細(xì)胞中， 沒(méi)有觀察到B細(xì)胞的marker基因的表達(dá)爽待。

這是marker基因表達(dá)的熱圖损同。

圖中分成兩塊，左邊這塊鸟款，是屬于神經(jīng)血管的元細(xì)胞

右邊這塊膏燃，是神經(jīng)血管之外的元細(xì)胞，

我們可以看到欠雌，神經(jīng)血管的元細(xì)胞的marker基因表達(dá)蹄梢，

與非神經(jīng)血管的元細(xì)胞的marker基因表達(dá)，差異很大

這讓作者可以清楚地把兩群元細(xì)胞給分開(kāi)富俄。

而且禁炒，我們可以看到CD19在神經(jīng)血管的細(xì)胞中，有高表達(dá)

在別的細(xì)胞中霍比，CD19的表達(dá)量很低

進(jìn)一步的數(shù)據(jù)分析幕袱，可以看到，CD19不僅在周細(xì)胞中表達(dá)悠瞬，還在內(nèi)皮細(xì)胞中有表達(dá)

接著们豌，作者把非神經(jīng)元的細(xì)胞亞群，做成UMAP圖浅妆，

并且把這些細(xì)胞分別按細(xì)胞簇望迎、時(shí)間、空間凌外，做了區(qū)分

接著辩尊，作者做了各種細(xì)胞對(duì)應(yīng)marker基因的表達(dá)

可以看到CD19的表達(dá)，與血管平滑肌細(xì)胞康辑、周細(xì)胞摄欲、皮細(xì)胞，是有交集的

這是從發(fā)育的時(shí)間軸上看各marker基因的表達(dá)疮薇。

橫軸是發(fā)育的時(shí)間軸胸墙，可以看到，15周胎齡之前CD19的表達(dá)很少按咒，20周之后迟隅，有CD19的表達(dá)

為了看不同年齡的人的大腦中CD19基因的表達(dá)，

作者找了500個(gè)人類(lèi)大腦不同時(shí)期、不同大腦部位的樣本進(jìn)行分析

圖中藍(lán)色的點(diǎn)是出生之前的大腦樣本中CD19基因的表達(dá)情況玻淑，

棕色的點(diǎn)是出生之后嗽冒，一直到40歲，大腦樣本中的CD19基因的表達(dá)情況补履。

我們可以看到自始至終添坊，大腦一直都有CD19的表達(dá)。

同樣箫锤，我們可以看到贬蛙，CD248這個(gè)mural細(xì)胞的marker基因，也自始致終有表達(dá)

令作者吃驚的是谚攒，CD248, CSPG4, ANPEP, FOXS1, 和FN1這些基因的表達(dá)

與CD19的表達(dá)的相關(guān)性阳准，排在前1%

作者對(duì)與CD19表達(dá)相關(guān)性最高的200個(gè)基因做GO富集，

發(fā)現(xiàn)富集的條目是與神經(jīng)血管單元馏臭、血管生長(zhǎng)野蝇、對(duì)流體切變力的響應(yīng)、和多種細(xì)胞外間質(zhì)

這些條目是相關(guān)的

這提示括儒，CD19在成年人大腦中的表達(dá)绕沈，與mural細(xì)胞的豐富程度有關(guān)，而與B細(xì)胞不太有關(guān)系

看各種細(xì)胞中含CD19和marker基因的含量

CD19和CSPG4在周細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)較高帮寻。

B細(xì)胞中富集的CD22和CD74乍狐，在周細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)較少

臨床上使用的針對(duì)CD19的CAR-T是針對(duì)CD19的第4個(gè)外顯子的。

另外固逗，跳過(guò)第2個(gè)外顯子的CD19的突變蛋白浅蚪，會(huì)缺乏向細(xì)胞表面的轉(zhuǎn)運(yùn)，

因此烫罩，作者分析了大腦中表達(dá)的CD19的各個(gè)外顯子的表達(dá)水平

圖中惜傲，從左到右分成15段，每一段就是一段CD19的外顯子贝攒。

可以看到操漠，各個(gè)外顯子的表達(dá)均勻分布，包括外顯子2和外顯子4饿这，都是均勻分布的

作者為了了解小鼠mural細(xì)胞中是否有CD19的表達(dá)，進(jìn)行了研究撞秋。

從健康的C57BL/6J小鼠中提取并分離了全腦长捧。

并通過(guò)流式細(xì)胞儀的分析，證明了有表達(dá)CD19的細(xì)胞存在吻贿，盡管表達(dá)CD19的細(xì)胞的數(shù)量較少串结。

相比于人類(lèi)大腦中的CD19的表達(dá)水平，小鼠大腦中的CD19的表達(dá)水平相對(duì)較低

作者針對(duì)小鼠和人類(lèi)的CD19分別做CAR-T細(xì)胞。

一共做了三種CAR-T細(xì)胞

CAR-T細(xì)胞的CAR分子設(shè)計(jì)中有兩個(gè)關(guān)注點(diǎn)

1肌割、左邊針對(duì)的目標(biāo)分子有兩種卧蜓，一種是針對(duì)小鼠的CD19，另一種是針對(duì)人類(lèi)的CD19

小鼠的就用字母m開(kāi)頭把敞，人類(lèi)的就用字母h開(kāi)頭

2弥奸、第三段基因片段，有兩種選擇奋早，分別是4-1BB和CD28

這樣盛霎，就有了三種CAR分子

然后，作者對(duì)兩種培養(yǎng)細(xì)胞耽装，用三種CAR-T做了CAR-T的裂解實(shí)驗(yàn)愤炸。

被裂解的兩種培養(yǎng)細(xì)胞，分別是人類(lèi)的掉奄、和小鼠的规个。

左邊的這是Nalm6細(xì)胞，是培養(yǎng)的人類(lèi)細(xì)胞姓建。

我們可以看到诞仓，是紅線(xiàn)的裂解率最高

也就是針對(duì)人類(lèi)CD19的CAR-T對(duì)Nalm6這種人類(lèi)的細(xì)胞的殺傷力最強(qiáng)

右邊的這是A20細(xì)胞，是培養(yǎng)的小鼠細(xì)胞

我們可以看到引瀑，是綠線(xiàn)的裂解率最高

也就是針對(duì)小鼠的CD19狂芋，并且用CD28作為CAR分子第三段的這種CAR-T，它的裂解率最高

接著憨栽，作者對(duì)特殊的NSG小鼠做CAR-T處理帜矾。

這種NSG小鼠的特點(diǎn)是它是免疫缺陷的，它沒(méi)有B細(xì)胞屑柔。

之所以選用這種小鼠

是因?yàn)楸卷?xiàng)研究屡萤，就是看針對(duì)CD19的CAR-T治療對(duì)B細(xì)胞之外的細(xì)胞、器官造成的傷害

那么NSG小鼠沒(méi)有B細(xì)胞掸宛，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中就可以排除因?yàn)镃AR-T進(jìn)攻B細(xì)胞造成的傷害

所觀察到的傷害死陆，都排除了B細(xì)胞的影響

我們看圖，圖中是NSG小鼠在經(jīng)過(guò)CAR-T處理后唧瘾，大腦的切片染色結(jié)果

藍(lán)色是DAPI染色措译，是對(duì)細(xì)胞核的染色。

紅色是EBD染色饰序，體現(xiàn)的是血腦屏障的滲漏

圖片分兩排领虹，上面一排是大圖，下面一排是上面大圖中那些小白框內(nèi)的圖形放大后的效果求豫。

圖片分5列

最左邊的一列塌衰，是甘露醇（處理后的效果）

甘露醇是能夠讓血腦屏障的滲漏變高的一種化合物诉稍，在這里，相當(dāng)于一個(gè)檢測(cè)血腦屏障滲潳的陽(yáng)性對(duì)照

第二列最疆，沒(méi)有加T細(xì)胞處理杯巨，也就是陰性對(duì)照

第三列到第五列，是3種CAR-T細(xì)胞的處理結(jié)果

可以明顯地看到努酸，第五列的圖中服爷，紅顏色是較明顯的

也就是說(shuō)，針對(duì)小鼠CD19的用CD28做基因第三段的CAR-T

較大程度地增加了小鼠血腦屏障的滲透性

這是對(duì)剛才圖像中EBD染色效果的熒光（強(qiáng)度）進(jìn)行定量分析的結(jié)果

可以看到mCD1928z這個(gè)CAR-T處理蚊逢，可以引起和甘露醇相近滲漏結(jié)果

另外层扶，mCD19BBz這個(gè)CAR-T處理，也會(huì)引起一定的滲漏結(jié)果

這是作者用另一個(gè)“有免疫功能的”小鼠做血腦屏障滲漏實(shí)驗(yàn)的結(jié)果烙荷。

我們可以看到镜会，在mCD1928z這個(gè)CAR-T處理的結(jié)果中，可以看到較強(qiáng)的紅顏色熒光

作者還用核磁共振技術(shù)终抽，來(lái)檢查了小鼠經(jīng)過(guò)CAR-T治療之后戳表，血腦屏障的滲漏

這張圖中，腦子部分滲漏的情況越重的昼伴，顏色標(biāo)得越偏紅

可以看到匾旭，甘露醇處理的腦子，顏色最紅

而余下的4個(gè)樣本中圃郊，是用mCD1928z這個(gè)CAR-T處理后的腦子价涝，顏色最紅

最右邊的圖，是對(duì)核磁共振檢測(cè)到的小鼠大腦的滲漏情況做一個(gè)定量的分析

圖中顯示持舆，mCD1928z這個(gè)樣本的滲漏色瘩，在各個(gè)實(shí)驗(yàn)樣本中是最高的

這是作者把CAR-T處理后四天的小鼠腦組織解離后，用熒光流式細(xì)胞儀來(lái)做檢測(cè)

看其中的表達(dá)CD19的細(xì)胞的數(shù)量

上面的圖逸寓，是檢測(cè)有CD45或CD41的細(xì)胞中居兆，同時(shí)有CD19表達(dá)的細(xì)胞

下面的圖，是檢測(cè)有CD13的細(xì)胞中竹伸，同時(shí)有表達(dá)CD19的細(xì)胞

我們可以看到泥栖，針對(duì)人的CAR-T和針對(duì)小鼠的CAR-T分別處理之后

針對(duì)人的這組剩下的有CD19表達(dá)的細(xì)胞的比例，都高于針對(duì)鼠的這一組勋篓。

量化的計(jì)算的結(jié)果吧享，也是這樣的結(jié)論

也就是說(shuō)針對(duì)鼠的CAR-T對(duì)表達(dá)鼠CD19的細(xì)胞殺滅功能是最強(qiáng)的

作者接著做了腦與肺的mural細(xì)胞表達(dá)分析

之所以要做肺的mural細(xì)胞表達(dá)，是因?yàn)榉萎?dāng)中的周細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞特別多

作者想看這些細(xì)胞的基因表達(dá)與腦的mural細(xì)胞的表達(dá)有什么差異

以便為未來(lái)的CAR-T治療找到方向

經(jīng)過(guò)分析譬嚣，作者發(fā)現(xiàn)CD19在大腦中特異表達(dá)耙蔑，而在肺中幾乎沒(méi)有表達(dá)

而一些mural細(xì)胞的marker基因，如PDGFRB孤荣、RGS5甸陌、FOXS1和KCNJ8，在大腦和肺臟中都有表達(dá)

之前已經(jīng)有科學(xué)家提出了用針對(duì)兩種目標(biāo)抗原的盐股，

分別用“AND”或“NOT”方法來(lái)精選目標(biāo)細(xì)胞的CAR-T治療

所謂AND钱豁，就是要同時(shí)有對(duì)應(yīng)到兩種特定抗原的細(xì)胞，CAR-T才會(huì)啟動(dòng)殺滅功能

那NOT疯汁，就是有A目標(biāo)抗原牲尺，但沒(méi)有B目標(biāo)抗原的細(xì)胞，CAR-T才會(huì)啟動(dòng)殺滅功能

那么現(xiàn)在有了精細(xì)的各種細(xì)胞的marker基因幌蚊，也就為接下來(lái)的CAR-T研究提出了新的可行思路