單細胞測序的知識

劉小澤寫于18.7.20
https://hemberg-lab.github.io/scRNA.seq.course/index.html

介紹

Bulk RNA-seq:

測量一個大的細胞群體中每一個基因的平均表達水平竞膳，對比較轉(zhuǎn)錄組學（例如比較不同物種的相同組織）是有幫助的外冀，但對于研究異質(zhì)性系統(tǒng)（例如，復(fù)雜的組織如腦）還是不夠的巢掺，對于基因表達的本質(zhì)研究不夠深入

scRNA-seq：

2009年由Tang發(fā)表，但直到14年才降低測序費用后频，逐漸進入大家的視野卖陵。它測定的是細胞種群中每個基因的表達量分布，對于研究特定細胞轉(zhuǎn)錄組的變化是重要的喇聊。測定的細胞量也由最初的10² 漲到了10⁶ 并且還在遞增，向著高通量的方向發(fā)展”目瘢現(xiàn)在有許多處理單細胞測序的流程承疲，比如13年的SAMRT-seq2，12年的CELL-seq鸥咖，15年的Drop-seq燕鸽。有一些做單細胞的平臺，包括Fluidigm C1啼辣、Wafergen ICELL8啊研、10X Genomics Chromium。

發(fā)展歷史

單細胞測序的流程：

測序流程

看著和普通的mRNA轉(zhuǎn)錄組差不多鸥拧，取材要求更高了

分析流程

黃色部分對于高通量數(shù)據(jù)的處理都是差不多的流程党远；橙色的部分需要整合多個轉(zhuǎn)錄組分析流程以及顯著性分析，來解決單細胞測序的技術(shù)誤差富弦；最后是下游表達量沟娱、通路、互作網(wǎng)絡(luò)等生物類別的分析腕柜，需要使用針對單細胞研發(fā)的方法

可以借助許多工具：

Falco [云端處理流程]
SCONE(Single-Cell Overview of Normalized Expression)—一個質(zhì)控和標準化的包
Seurat-- QC以及后續(xù)分析探索數(shù)據(jù)
ASAP(Automated Single-cell Analysis Pipeline) —交互式網(wǎng)頁分析

面臨挑戰(zhàn)：

單細胞轉(zhuǎn)錄組與群體轉(zhuǎn)錄組的最大不同之一就是：測序文庫是建立在單獨一個細胞上的济似，并非一群細胞。單細胞目前面臨的挑戰(zhàn)主要是：擴增量目前最多是一百萬個細胞盏缤；有可能一個基因在一個細胞中能檢測到中等表達量砰蠢，但是在另一個細胞中卻檢測不到，這種現(xiàn)象叫做"gene dropouts"唉铜。下一步需要增加轉(zhuǎn)錄本捕獲效率台舱，減少擴增誤差

分析方法：

近幾年，發(fā)展起來的方法很多潭流，大體上（并不全面）包括：

CEL-seq (Hashimshony, 2012)
CEL-seq2(Hashimshony, 2016)
Drop-seq(Macosko, 2015)
InDrop-seq (Klein, 2015)
MARS-seq(Jaitin, 2014)
SCRB-seq(Soumillon, 2014)
Seq-well (Gierahn, 2017)
Smart-seq (Picelli, 2014)
Smart-seq2 (Picelli, 2014)
SMARTer
STRT-seq (Islam, 2013)

方法主要分為兩大部分：定量與捕獲竞惋。

定量包括兩種類型：全長以及基于標簽(tag)。前者對每個轉(zhuǎn)錄本都試圖獲得一致的read覆蓋度灰嫉，后者只捕獲5‘或者3’端的RNA拆宛。定量方法的選擇也影響了后續(xù)分析的方法選擇。理論上熬甫，全長的方法應(yīng)該得到轉(zhuǎn)錄本的平均覆蓋度胰挑，但是實際上，覆蓋度經(jīng)常是有偏差的椿肩≌八蹋基于標簽的方法能夠利用特異性分子標記(Unique Molecular Identifiers, UMIs)提高定量準確度，但是呢郑象，這種限制了轉(zhuǎn)錄組一端的方法有降低了轉(zhuǎn)錄本的可拼接性贡这，讓以后的isoform識別變得困難。
捕獲的技術(shù)決定了細胞如何被篩選厂榛、獲取怎樣的測序外的補充信息盖矫、數(shù)據(jù)產(chǎn)量，三種最常用的方法是基于微孔microwell-击奶、微液流microfluidic-辈双、微滴droplet-

基于微孔的捕獲技術(shù)可以使用細胞移液器或激光捕獲分離細胞，并將他們放置于微液流孔中柜砾。這樣的一個優(yōu)勢就是：可以與熒光觸發(fā)細胞分離技術(shù)(FACS)結(jié)合湃望，實現(xiàn)基于表面標記的細胞選擇。對于想要分離特定細胞群的研究很有效痰驱；另外一個優(yōu)勢就是证芭，可以對細胞進行拍照，幫助確定孔中是否存在損傷的或者重復(fù)的細胞担映。當然废士，他也有缺點，通量低蝇完，對每個細胞進行操作需要很大的工作量官硝。

基于微液流的捕獲技術(shù) 例如Fluidigm's C1

Fluidigm's C1

相對微孔，它的通量更高短蜕。但是他的弱點就是：只有10%的細胞能被捕獲到泛源，加入處理的細胞類型比較稀少，那么能被芯片捕獲的就更少了忿危，數(shù)據(jù)產(chǎn)出是不夠的达箍。另外芯片相對較貴，但是試劑的價格再降低铺厨，日后可能總的價格也會下降缎玫。

微滴技術(shù) 是將單個細胞包裹在μl級別的液滴中，液滴被搭載到建庫所用的酶上解滓，每個微滴包含一個獨特的條碼(barcode)赃磨，由那個被包裝好的細胞產(chǎn)生的所有reads都被貼上了該條碼，也是為了之后對于不同細胞reads的分辨洼裤。一般微滴技術(shù)的通量最大邻辉，查資料得知一秒能包裝7萬個以上的液滴，并且建庫費用合適--0.05美元/細胞。但是高額測序費用又成了他的短板值骇，鑒定出的一般只有一千多個差異轉(zhuǎn)錄本莹菱，覆蓋度還是比較低的

微滴技術(shù)

如何根據(jù)實驗選擇測序平臺？

關(guān)于捕獲吱瘩，比如：如果想要分析組織中的成分道伟，那么微滴技術(shù)可以提供數(shù)量可觀的細胞；如果研究的細胞種群比較稀少使碾，并且有已知的標記蜜徽，那么最好用FACS，測少量細胞即可票摇；關(guān)于定量拘鞋，比如：如果想要研究不同的轉(zhuǎn)錄本，由于標簽是有限的矢门，不可能全部標記完這些轉(zhuǎn)錄本掐禁，那么全長的轉(zhuǎn)錄本定量就更合適；UMIs只能用于使用標簽的方法颅和，在基因水平做定量更有優(yōu)勢傅事。

2017年Ziegenhain所在的Enard團隊和Svensson所在的Teichmann團隊都比較了不同的方法組合：

Ziegenhain使用同樣的小鼠胚胎干細胞(mouse embryonic stem cells，mESCs)分析了5種不同的方法峡扩，控制細胞數(shù)量蹭越、測序深度一致，比較了方法的檢測靈敏度教届、噪聲水平以及各個方法的費用响鹃。結(jié)果顯示了檢測到基因的數(shù)目（給定一個檢測閾值），結(jié)果顯示drop-seq檢測到的基因數(shù)目比Smart-seq2低了兩倍案训。因此买置，方法的選擇對于實驗結(jié)果很重要！

Enard團隊

Svensson使用的是已知濃度的合成的轉(zhuǎn)錄本(加入了spike-in)來檢測不同方法的準確度和敏感度

Teichmann團隊

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