1.R蛋白的開(kāi)關(guān)平衡 2016-Plant Cell
本文以亞麻不同R蛋白allele為切入點(diǎn)，鑒定到了TIR domain和NB-ARC domain中調(diào)控R蛋白活性的位點(diǎn)避诽。并進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)激活的R蛋白更易結(jié)合ATP，而活性降低的R蛋白則更傾向于結(jié)合ADP锋勺。另外，和ATP結(jié)合的蛋白和effector結(jié)合得也更緊密狡蝶。本文進(jìn)一步驗(yàn)證了R蛋白可作為分子開(kāi)關(guān)庶橱，通過(guò)和ATP/ADP的結(jié)合，調(diào)節(jié)植物免疫的模型贪惹。
Take Home Message：
- 提取酵母蛋白方法： postalkaline extraction method
Kushnirov, V.V. (2000). Rapid and reliable protein extraction from yeast. Yeast 16: 857–860.
R蛋白的體外表達(dá)比較困難苏章，本文使用酵母表達(dá)。并且使用從酵母中純化的R蛋白直接檢測(cè)蛋白結(jié)合的酵母內(nèi)源的ATP/ADP奏瞬，這應(yīng)該屬于半體內(nèi)實(shí)驗(yàn)枫绅。
檢測(cè)ATP/ADP含量，ATPase活性的相關(guān)試劑盒
腺苷 5′-三磷酸（ATP）生物發(fā)光測(cè)定試劑盒 ：Sigma, 貨號(hào)：FLAA-1KT
二磷酸腺苷（ADP）檢測(cè)試劑盒（比色法/熒光法）：sigma硼端，貨號(hào)：MAK033-1KT
ADP/ATP 比率檢測(cè)試劑盒：sigma并淋，貨號(hào)：MAK135-1KT
ATP酶/GTP酶活性檢測(cè)試劑盒：sigma，貨號(hào)：MAK113-1KT
2. NALP3結(jié)合ATP誘導(dǎo)炎癥反應(yīng) 2007-PNAS
Cryopyrin參與動(dòng)物多聚炎癥復(fù)合體的形成珍昨，屬于nucleotide-binding蛋白家族县耽。本文通過(guò)親和色譜法，純化到了Cryopyrin蛋白全長(zhǎng)镣典，證明Cryopyrin可以結(jié)合ATP并具有ATPase的活性兔毙。當(dāng)P-loop上的保守位點(diǎn)突變后導(dǎo)致不能結(jié)合ATP，影響自我互作兄春，以及和下游互作蛋白的互作澎剥，最終不能誘發(fā)炎癥反應(yīng)。
本文說(shuō)明了Cryopyrin這類蛋白的核酸結(jié)合活性對(duì)其功能的行使是非常重要的赶舆。另外肴裙，自我互作以及和其他蛋白的互作也是行使正常功能所必需的趾唱。
Take Home Message：
- 證明ATP結(jié)合活性的實(shí)驗(yàn)：ATPγS結(jié)合，競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)蜻懦，ATP-agarose結(jié)合
ATPγS：腺苷5′-(β,γ-硫代)三磷酸鹽 鋰鹽 水合物，sigma夕晓，A2647-5MG
ATP-agarose：sigma宛乃，A4793-1ML
ADP-agrose：sigma，蒸辆，A3515-5ML
- 和植物中的R蛋白類似征炼，這類蛋白自我互作形成寡聚體或多聚體可能非常重要，而且核酸結(jié)合活性可能對(duì)這一過(guò)程影響非常大躬贡。
3.effector誘導(dǎo)R蛋白寡聚化 2006-PC
本研究發(fā)現(xiàn)谆奥，elicitor會(huì)誘導(dǎo)R蛋白的寡聚化（自我互作），而且這種寡聚化依賴于elicitor拂玻。P-loop突變后酸些，elicitor無(wú)法誘導(dǎo)R蛋白的寡聚化，說(shuō)明P-loop在elicitor誘導(dǎo)的寡聚化中非常重要檐蚜。P-loop會(huì)影響R蛋白和ATP/ADP的結(jié)合魄懂，這也從側(cè)面說(shuō)明了結(jié)合ADP/ATP會(huì)影響R蛋白的寡聚化。
Take Home Message：
將R蛋白連接不同的tag闯第，使用Co-IP檢測(cè)R蛋白是否可以寡聚化市栗。
