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WGCNA筆記第一彈
1.WGCNA簡(jiǎn)介
WGCNA(Weighted Gene Co-Expression Network Analysis, 加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析)芹橡，鑒定表達(dá)模式相似的基因集合（module）前弯。解析基因集合與樣品表型之間的聯(lián)系打厘，繪制基因集合中基因之間的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)并鑒定關(guān)鍵調(diào)控基因修肠。
WGCNA適合于復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)
研究不同器官/組織類(lèi)型和不同階段的發(fā)育調(diào)控、生物和非生物脅迫的不同時(shí)間點(diǎn)響應(yīng)機(jī)制
2.主要內(nèi)容
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一户盯、WGCNA原理
1.構(gòu)建基因關(guān)系網(wǎng)絡(luò)
2.構(gòu)建基因模塊
3.篩選關(guān)鍵基因
4.鑒定關(guān)鍵基因
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二嵌施、WGCNA應(yīng)用
- 1.應(yīng)用場(chǎng)景-實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、經(jīng)典文獻(xiàn)
- 2.實(shí)例分析-單個(gè)材料莽鸭、兩個(gè)材料
- 3.實(shí)例分析-結(jié)合表型
三吗伤、WGCNA實(shí)戰(zhàn)
3.WGCNA原理
4.構(gòu)建基因關(guān)系網(wǎng)絡(luò)
4.1 計(jì)算基因間相關(guān)關(guān)系
基因間相似性（similarity）：根據(jù)基因在不同樣品中的表達(dá)情況，計(jì)算任意兩個(gè)基因間的相關(guān)關(guān)系硫眨。用Pearson相關(guān)系數(shù)
基因共表達(dá)矩陣： S=[Sij]
Sij 表示基因i和基因j的Pearson相關(guān)系數(shù)足淆。
軟閾值：通過(guò)加權(quán)函數(shù)將相關(guān)系數(shù)變換，形成鄰接矩陣（Adjacency Matrix）,矩陣中元素連續(xù)化捺球。
鄰接函數(shù)：power函數(shù)（冪指數(shù)函數(shù)）
aij=power(Sij, β)=|Sij|β
需要確定鄰接函數(shù)的參數(shù)β缸浦，依據(jù)無(wú)尺度網(wǎng)絡(luò)原則，即基因表達(dá)網(wǎng)絡(luò)符合無(wú)尺度網(wǎng)絡(luò)的冪函數(shù)分布
4.2 無(wú)尺度網(wǎng)絡(luò)
網(wǎng)絡(luò)圖的點(diǎn)指圖中的每一個(gè)節(jié)點(diǎn)氮兵，度指與該點(diǎn)的連接數(shù)
隨機(jī)網(wǎng)絡(luò)（Random network）裂逐，每個(gè)節(jié)點(diǎn)的度相對(duì)平均
無(wú)尺度網(wǎng)絡(luò)（Scale-free network），少數(shù)節(jié)點(diǎn)具有明顯高于一般點(diǎn)的度泣栈，這些點(diǎn)被稱(chēng)為hub卜高，由少數(shù)hub與其他節(jié)點(diǎn)關(guān)聯(lián)，最終構(gòu)成整個(gè)網(wǎng)絡(luò)
無(wú)尺度網(wǎng)絡(luò)的冪率分布：節(jié)點(diǎn)連接數(shù)為k的節(jié)點(diǎn)數(shù)h南片，k與h成反比掺涛，負(fù)相關(guān)
尺度：隨機(jī)網(wǎng)絡(luò)中每個(gè)節(jié)點(diǎn)的連接數(shù)符合泊松分布，大部分節(jié)點(diǎn)的連接數(shù)居中疼进，中值稱(chēng)為隨機(jī)網(wǎng)絡(luò)的尺度薪缆。
無(wú)尺度網(wǎng)絡(luò)符合冪率分布，大多數(shù)點(diǎn)只有很少的連接伞广，少數(shù)點(diǎn)有很多的連接
基因相關(guān)關(guān)系拣帽，冪函數(shù)處理后，少數(shù)強(qiáng)相關(guān)性不受影響或者影響較小嚼锄，而相關(guān)性弱的取n次冪后命黔，相關(guān)性明顯下降煤傍。
4.3 確定關(guān)鍵參數(shù)β
尋找合適的β链方，使得基因表達(dá)關(guān)系符合無(wú)尺度網(wǎng)絡(luò)橱野，度數(shù)高的節(jié)點(diǎn)少修陡，度數(shù)低的節(jié)點(diǎn)多。
節(jié)點(diǎn)度數(shù)k與具有該度數(shù)節(jié)點(diǎn)的個(gè)數(shù)h服從冪律分布
具體計(jì)算度數(shù)為k的節(jié)點(diǎn)個(gè)數(shù)的對(duì)數(shù)值log（k）可霎，與該節(jié)點(diǎn)出現(xiàn)的概率對(duì)數(shù)（log(p(k))）呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)魄鸦，一般會(huì)設(shè)置相關(guān)系數(shù)大于0.8
為了檢測(cè)設(shè)置的參數(shù)β是否滿足無(wú)尺度網(wǎng)絡(luò)，對(duì)log10(p(k))和log10(k)作圖癣朗，同時(shí)為更好評(píng)估号杏，對(duì)兩者之間的相關(guān)系數(shù)做平方，即R2斯棒。如果模型R2接近1，則兩者之間為很好的線性關(guān)系主经。
4.4 計(jì)算基因間表達(dá)關(guān)系
評(píng)估基因間表達(dá)關(guān)系：直接關(guān)系
生物體內(nèi)基因間的關(guān)系：直接關(guān)系+間接關(guān)系
TOM：用拓?fù)渲丿B（topological overlap measure荣暮，TOM）來(lái)計(jì)算基因之間關(guān)聯(lián)程度，除了分析兩個(gè)基因之間的關(guān)系罩驻，還考慮這兩個(gè)基因與其他基因之間的連接穗酥。這樣更具有生物學(xué)意義。
建立TOM矩陣
TOM公式中惠遏，計(jì)算i與j之間的關(guān)系砾跃，不僅考慮了i和j的直接關(guān)系，還考慮了第三個(gè)基因μ的間接關(guān)系
5 構(gòu)建基因模塊
5.1 層次聚類(lèi)樹(shù)
基因模塊的劃分基于基因間的連接稀疏性节吮，將TOM矩陣（Similarity）轉(zhuǎn)化為相異度矩陣（Dissimilarity）:
利用基于TOM值的相異度層次聚類(lèi)建樹(shù)
建樹(shù)方法：動(dòng)態(tài)剪切樹(shù)和靜態(tài)剪切樹(shù)
5.2 動(dòng)態(tài)混合剪切法
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第一步：識(shí)別滿足設(shè)定條件的初級(jí)模塊
- 1.滿足模塊預(yù)定義的最低基因數(shù)目
- 2.距離集群過(guò)遠(yuǎn)的基因抽高，即使與集群處于同一分支，也去除
- 3.每個(gè)集群與其他周?chē)募猴@著不同
- 4.處在樹(shù)分支尖端的每個(gè)群集的核心基因緊密相連
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第二步：測(cè)試步驟
- 將未分配的基因進(jìn)行測(cè)試透绩，如果足夠接近某個(gè)初級(jí)群集翘骂，則分配進(jìn)去
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通常WGCNA使用動(dòng)態(tài)混合剪切法建樹(shù)
5.3 建樹(shù)過(guò)程的參數(shù)
模塊最少基因數(shù)目（minModuleSize）
合并模塊的最小距離（mincutHeight）計(jì)算模塊的特征值，利用模塊特征值建樹(shù)帚豪，合并距離很近的模塊（如Height小于0.2）
模塊特征值（Epigengene）
模塊內(nèi)所有基因進(jìn)行主成分分析（PCA）碳竟，第一主成分的值即為Epigengene。它代表該模塊內(nèi)基因表達(dá)的整體水平
6 篩選基因模塊
主要介紹四種方法
6.1 表達(dá)模式分析
模塊表達(dá)模式分析：模塊在各個(gè)樣品中的豐度
模塊特征值（Epigengene）：模塊內(nèi)所有基因進(jìn)行主成分分析（PCA）狸臣，第一主成分的值即為Epigengene莹桅。它代表該模塊內(nèi)基因表達(dá)的整體水平。
如果某模塊在樣品中特征值正或負(fù)表達(dá)較高烛亦，說(shuō)明模塊與這個(gè)樣品關(guān)系緊密
6.2 模塊與表型性狀關(guān)聯(lián)分析
模塊顯著性值（Module significance诈泼，MS）：模塊內(nèi)所有基因的基因顯著性值的平均值。
基因顯著性值（Gene significance, GS）:基因表達(dá)水平與因變量水平的相關(guān)系數(shù)此洲。用T檢驗(yàn)計(jì)算每個(gè)基因在不同表型樣品組間的差異表達(dá)顯著性檢驗(yàn)P值（Pearson相關(guān)系數(shù)）厂汗，通常將P值取以10底對(duì)數(shù)值定義為基因顯著性GS
計(jì)算各模塊與一表型性狀的MS值，如一個(gè)模塊的MS值顯著高于其他模塊呜师，則這一模塊與該性狀存在關(guān)聯(lián)關(guān)系
模塊特征值顯著性（Epigengene significance, ES）:模塊特征值與某一性狀的相關(guān)系數(shù)娶桦，篩選與性狀關(guān)聯(lián)度最高的模塊
6.3 富集分析
對(duì)各個(gè)模塊都進(jìn)行GO和KEGG富集分析，找出與我們研究性狀相關(guān)通路相關(guān)性最強(qiáng)的模塊進(jìn)行深入挖掘
6.4 依據(jù)目標(biāo)基因篩選模塊
依據(jù)研究目的、前期研究結(jié)果和已發(fā)表文獻(xiàn)衷畦，有重點(diǎn)關(guān)注的目標(biāo)基因栗涂，可直接篩選目標(biāo)基因所在的基因模塊重點(diǎn)進(jìn)一步分析
7 鑒定關(guān)鍵基因
7.1 模塊內(nèi)部基因連接度分析
Connectivity(degree)-連接度：與某個(gè)基因連接的所有其他基因的總和，即描述一個(gè)基因與其他所有基因的關(guān)聯(lián)程度祈争，一般用K值表示斤程。
Intramodular connectivity KIM-模塊內(nèi)部連接度IC:某個(gè)模塊中的基因與該模塊中其他基因的關(guān)聯(lián)程度（共表達(dá)程度）∑谢欤可用來(lái)衡量模塊身份（module membership,MM).
Module Membership MM,or Epigengene-based connectivity KME:模塊身份忿墅，用一個(gè)基因在所有樣本中的表達(dá)語(yǔ)與某個(gè)模塊特征值的表達(dá)譜的相關(guān)性，來(lái)衡量這個(gè)基因在這個(gè)模塊中的身份沮峡。
KME值接近0,說(shuō)明這個(gè)基因不是該模塊的成員：KME接近1或者－1,說(shuō)明這個(gè)基因與該模塊密切相關(guān)（正相關(guān)或者負(fù)相關(guān)）疚脐。
可以對(duì)所有基因計(jì)算相對(duì)某個(gè)模塊的KME值，并不一定要是該模塊的成員邢疙。
KME與KIM高度相關(guān)棍弄。某個(gè)模塊中KIM值高的hub基因一定與該模塊的KME也很高。
KME與KIM的區(qū)別：IC衡量基因在特定模塊中的身份疟游，MM衡量基因在全局網(wǎng)絡(luò)中的位置呼畸。
篩選關(guān)鍵基因：
TOM值（模塊調(diào)控系表中的weight值）大于閾值（默認(rèn)是0.15)的兩個(gè)基因才認(rèn)為是相關(guān)的，然后計(jì)算每個(gè)基因的連接度颁虐。即先篩選有足夠強(qiáng)度的關(guān)系蛮原，然后計(jì)算連接度。
模塊內(nèi)部高連接度的基因聪廉，模塊內(nèi)排名前30或者10%(KME或KIM).
篩選關(guān)鍵基因：將該基因模塊身份MM相對(duì)于基因顯著性GS做散點(diǎn)圖瞬痘，選擇右上角MM和GS均高的基因進(jìn)一步分析。
基因顯著性值（Gene significance,GS)因變量水平的相關(guān)系數(shù)板熊。衡量基因與表型性狀的關(guān)聯(lián)程度框全，GS越高，說(shuō)明與表型越相關(guān)干签，越具有生物學(xué)意義津辩。GS可以為正值或負(fù)值（正相關(guān)或負(fù)相關(guān)）
Cytoscape中一般用weight值（TOM值）來(lái)繪制網(wǎng)絡(luò)圖。
7.2 特定功能基因分析
高連通性的基因一般位于調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的上游容劳；低連通性的基因一般位于調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的下游喘沿。
調(diào)控網(wǎng)絡(luò)上游一般是調(diào)控因子，如轉(zhuǎn)錄因子竭贩；下游一般是功能性的酶或蛋白分子
重點(diǎn)關(guān)注具有調(diào)控功能的基因蚜印，典型的為轉(zhuǎn)錄因子，這些基因往往是關(guān)鍵基因
7.3 目標(biāo)基因關(guān)聯(lián)分析
依據(jù)研究目的留量，選取跟目標(biāo)基因關(guān)系緊密的基因窄赋，如篩選與目標(biāo)基因的TOM值排名前10哟冬，或者TOM值大于0.2的基因
可準(zhǔn)確篩選與目標(biāo)基因存在上下游調(diào)控關(guān)系的候選基因
當(dāng)目標(biāo)基因連接度不高時(shí)，可篩選與目標(biāo)基因TOM值很高忆绰，且自身連接度也很高的基因
參考文獻(xiàn)：
Langfelder, P., Horvath, S. WGCNA: an R package for weighted correlation network analysis. BMC Bioinformatics 9, 559 (2008). https://doi.org/10.1186/1471-2105-9-559
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