Cell |合成細(xì)胞通訊系統(tǒng)摄狱，可控制細(xì)胞密度

原創(chuàng)?舊島望月亮?圖靈基因?

收錄于話題#前沿分子生物學(xué)技術(shù)

撰文：舊島望月亮

IF=41.582

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亮點(diǎn)：

1.作者利用基因工程技術(shù)設(shè)計了人工合成的細(xì)胞通訊系統(tǒng)颊乘。

2.在該研究的基礎(chǔ)上歧蒋，未來可以進(jìn)一步設(shè)計更為復(fù)雜的系統(tǒng)用于協(xié)調(diào)控制多種類型的細(xì)胞。

細(xì)胞增殖作為生物體的重要生命特征偿曙，是生物生長氮凝、發(fā)育、繁殖以及遺傳的基礎(chǔ)遥昧。多細(xì)胞生物可以通過細(xì)胞分裂的方式產(chǎn)生新細(xì)胞覆醇，用于替換體內(nèi)衰老或死亡的細(xì)胞。除此之外炭臭，細(xì)胞還可以通過細(xì)胞間的通訊系統(tǒng)永脓，主動感知和控制種群密度。2022年3月1日加州理工學(xué)院Michael B.Elowitz等人利用基因工程技術(shù)設(shè)計了人工合成的細(xì)胞通訊系統(tǒng)鞋仍，旨在揭示控制種群密度的原理以及改進(jìn)現(xiàn)有的細(xì)胞療法常摧。其研究結(jié)果發(fā)表在名為”Synthetic mammalian signaling circuits for robust cell population control”的文章中。

圖1a展示了作者設(shè)計細(xì)胞通訊系統(tǒng)的基本思路。首先落午，理想的專用通訊系統(tǒng)要求Sender細(xì)胞產(chǎn)生的信號特異性地作用于Receiver細(xì)胞的目標(biāo)蛋白谎懦，并且該過程應(yīng)當(dāng)確保不會對改造前的宿主細(xì)胞產(chǎn)生影響(圖1a左)。接著對上述通訊系統(tǒng)進(jìn)行改進(jìn)溃斋，設(shè)計出了Sender-Receiver細(xì)胞界拦，它能根據(jù)感應(yīng)到的種群密度做出特定的反應(yīng)(圖1a中)。最后梗劫，在此基礎(chǔ)上使Sender-Receiver細(xì)胞產(chǎn)生的信號抑制細(xì)胞增殖享甸，進(jìn)而控制種群密度(圖1a右)。依據(jù)上述原理梳侨，用于設(shè)計改造的細(xì)胞信號通路需要滿足以下條件：不會與改造前的宿主細(xì)胞發(fā)生相互作用蛉威，能夠外部控制信號強(qiáng)度，適用于多種細(xì)胞類型走哺，能快速調(diào)節(jié)不同目標(biāo)蛋白的活性蚯嫌，具有較低的免疫原性等。生長素*作為一類植物特有的激素丙躏，能很好地滿足上述要求择示。

*生長素(auxin)：一類廣泛分布于植物體內(nèi)的激素，能促進(jìn)植物莖彼哼、根对妄、芽的生長。

圖1?細(xì)胞通訊系統(tǒng)的設(shè)計思路

首先敢朱，作者利用基因工程技術(shù)構(gòu)建了一個受生長素調(diào)控的Receiver細(xì)胞(圖2b)。在自然條件下摩瞎，生長素作用于轉(zhuǎn)運(yùn)抑制響應(yīng)蛋白1(TIR1)*拴签，促使其與目標(biāo)蛋白相結(jié)合，誘導(dǎo)形成SCF復(fù)合物*旗们。后者能招募E2泛素連接酶蚓哩，降解目標(biāo)蛋白。然而哺乳動物細(xì)胞內(nèi)并不存在TIR1及其作用靶點(diǎn)上渴，因此生長素不能直接用于降解哺乳動物的內(nèi)源性蛋白岸梨。先前的研究人員利用基因工程將目標(biāo)蛋白與生長素誘導(dǎo)降解因子(AID)*相連接。后者在生長素(黃圓)存在時稠氮，能與水稻中異位表達(dá)的TIR1(osTIR1)結(jié)合并組裝形成SCF復(fù)合體曹阔，再通過泛素化途徑對目標(biāo)蛋白進(jìn)行降解。利用上述原理隔披，作者選取BlastR*作為目標(biāo)蛋白赃份，從而構(gòu)建了由生長素調(diào)控細(xì)胞存活的通訊系統(tǒng)。此外，作者還在CHO-K1細(xì)胞*的基因上插入了mCherry*抓韩，用于標(biāo)記BlastR蛋白的濃度纠永。免疫熒光結(jié)果發(fā)現(xiàn)mCherry的熒光強(qiáng)度隨IAA*和NAA*兩種生長素濃度的增加而減少(圖2c)。在含有blasticidin S的培養(yǎng)液中添加IAA能降解BlastR蛋白并抑制細(xì)胞存活(圖2d)谒拴。上述結(jié)果表明尝江，通過基因工程設(shè)計的Receiver細(xì)胞能受到生長素的調(diào)控。

*轉(zhuǎn)運(yùn)抑制響應(yīng)蛋白1(transport inhibitor response 1, TIR1)：生長素的受體蛋白英上，屬于F-box蛋白質(zhì)家族炭序。它與生長素相結(jié)合，從而介導(dǎo)生長素發(fā)揮相應(yīng)作用善延。

*SCF復(fù)合物((Skp1-Cul1-F-box蛋白復(fù)合物)：一類泛素化連接酶少态，通過泛素化促進(jìn)蛋白酶體降解，在促使細(xì)胞進(jìn)入增殖周期中發(fā)揮重要作用易遣。

*BlastR(blasticidin S deaminase)：blasticidin S——即殺稻瘟菌素S彼妻，是一類核苷類抗生素，在低濃度下能導(dǎo)致細(xì)胞迅速死亡豆茫。其原理是通過干擾核糖體中肽鍵的形成侨歉，特異性抑制原核和真核生物的蛋白質(zhì)合成。而BlastR為blasticidin S的脫氨酶揩魂，其所編碼的蛋白質(zhì)能使細(xì)胞在blasticidin S存在的情況下存活幽邓。

*CHO-K1細(xì)胞：中國倉鼠卵巢細(xì)胞亞株。

*mCherry：一種紅色熒光蛋白火脉，吸收峰和發(fā)射峰分別為587和610nm牵舵。由于具有較好的光穩(wěn)定性，其常用于標(biāo)記某些細(xì)胞和分子倦挂。

*IAA(indole-3-acetic acid,?吲哚-3-乙酸)：一種天然的植物生長素畸颅。

*NAA(1-napthalenatic acid)：人工合成的生長素類似物

圖2?基因工程改造的Receiver細(xì)胞感知、響應(yīng)生長素

已有報道發(fā)現(xiàn)吲哚-3-乙酸水解酶方援，如iaaH没炒、Ax2和AMI1，能將生長素前體IAM和NAM水解成對應(yīng)的活性形式IAA和NAA(圖3a)犯戏。因此進(jìn)一步改造上述Receiver細(xì)胞送火，得到了Sender-Receiver細(xì)胞(圖3b)。將Sender-Receiver細(xì)胞在含有IAM的培養(yǎng)基中培養(yǎng)兩天先匪，取該培養(yǎng)液與新的培養(yǎng)基等比混合得到條件培養(yǎng)基种吸，之后用其培養(yǎng)Receiver細(xì)胞并觀察mCherry的熒光強(qiáng)度(圖3c)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)條件培養(yǎng)基具有與生長素IAA和NAA相同的降解作用(圖3d胚鸯，其中相比于NAM骨稿，IAM產(chǎn)生的降解效果更好)，說明Sender-Receiver細(xì)胞能夠有效地將生長素前體轉(zhuǎn)化為生長素，從而調(diào)控Receiver細(xì)胞的生長坦冠。

圖3?基因工程改造的Sender-Receiver細(xì)胞產(chǎn)生生長素

接著形耗，作者試圖研究Sender-Receiver細(xì)胞能否產(chǎn)生與種群大小成比例的生長素，進(jìn)而調(diào)控種群密度辙浑。在生長素前體IAM和NAM濃度足以產(chǎn)生飽和的生長素的情況下激涤，作者分析了細(xì)胞種群密度對BlastR基因表達(dá)的影響。由于加入IAM后BlastR基因表達(dá)顯著降低且不隨種群密度變化(圖4a)判呕，作者向Sender-Receiver細(xì)胞基因中插入生長素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白PIN2*倦踢，控制胞內(nèi)生長素濃度(圖4b)。結(jié)果表明Sender-Receiver細(xì)胞能在IAM(含PIN2)或NAM存在的情況下侠草，根據(jù)種群密度控制BlastR基因表達(dá)辱挥，從而實現(xiàn)對種群密度的感知。不同容量的培養(yǎng)基中mCherry的熒光強(qiáng)度對細(xì)胞密度的反應(yīng)相似边涕，說明其不受到細(xì)胞絕對數(shù)量的影響(圖4c)晤碘。將不同密度的細(xì)胞接種在含blasticidin S的培養(yǎng)液中，4天后測試細(xì)胞數(shù)量功蜓。結(jié)果發(fā)現(xiàn)园爷，IAM在高種群密度下能誘導(dǎo)Sender-Receiver-PIN2細(xì)胞死亡(圖4d)。

*PIN2：擬芥蘭中的一類轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白式撼，介導(dǎo)生長素的外排童社。

圖4?基因工程改造的細(xì)胞感知種群密度

在上述研究的基礎(chǔ)上，作者考慮了細(xì)胞發(fā)生基因突變后引起的逃逸反應(yīng)——即當(dāng)細(xì)胞對生長素不再敏感時著隆，BlastR能使細(xì)胞免受blasticidin S的傷害并持續(xù)增殖(圖5a下)扰楼。為了解決這一問題，作者對上述細(xì)胞模型加以改造得到了“矛盾”的控制系統(tǒng)Paradaux美浦，其基本思路為同時抑制細(xì)胞的增殖和凋亡來維持種群密度灭抑。另一方面當(dāng)細(xì)胞發(fā)生突變時，該通路能促進(jìn)細(xì)胞凋亡從而消滅逃逸細(xì)胞(圖5a上)抵代。根據(jù)這一思路，作者在先前設(shè)計的基礎(chǔ)上忘嫉，在細(xì)胞基因內(nèi)插入了連接AID的iCasp9基因荤牍，后者表達(dá)的蛋白能在小分子二聚體AP1903的作用下誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡(圖5b)。另外作者還利用mGFP*表征了iCasp9蛋白的濃度庆冕。此外康吵，由于該序列中未插入PIN2，所以作者選用生長素前體NAM啟動該系統(tǒng)访递。實驗結(jié)果表明在blasticidin S或AP1903單獨(dú)存在的情況下晦嵌，隨NAA的增加細(xì)胞存活率分別表現(xiàn)為降低或者增加(圖5d紅或綠)。利用上述數(shù)據(jù)計算Paradaux系統(tǒng)的數(shù)學(xué)模型，并對兩條曲線進(jìn)行擬合惭载，得到了blasticidin S和AP1903同時存在的情況下旱函，細(xì)胞存活率的變化趨勢(圖5d藍(lán)點(diǎn))。根據(jù)數(shù)學(xué)模型計算出能促使細(xì)胞種群密度保持恒定的blasticidin S和AP1903的濃度(圖5e)描滔，之后利用計算得到數(shù)據(jù)研究細(xì)胞在實際情況下的種群密度棒妨。實驗結(jié)果表明，與對照組細(xì)胞含长、Sender-Receiver細(xì)胞(負(fù)反饋組)相比券腔，Paradaux組細(xì)胞存活時間延長并且能在更長的時間內(nèi)保持種群密度的穩(wěn)定(圖5f)。

*mGFP：一種用于標(biāo)記的綠色熒光蛋白拘泞。

圖5?“Paradaux”通路控制細(xì)胞種群密度恒定

自然條件下纷纫，細(xì)胞能通過信號通路控制其種群密度。利用該原理陪腌，作者在哺乳動物細(xì)胞中設(shè)計了一種方法產(chǎn)生和響應(yīng)生長素辱魁，并將其與控制細(xì)胞增殖和凋亡的基因相聯(lián)系，從而調(diào)控種群密度偷厦。作者提出商叹，該通訊系統(tǒng)為設(shè)計多種類型細(xì)胞間的通訊和控制系統(tǒng)提供了可能性。例如為了記錄兩類細(xì)胞之間的相對距離只泼，人們可以把其中一類細(xì)胞設(shè)計成Receiver細(xì)胞剖笙，當(dāng)其與第二類細(xì)胞分泌的生長素相接觸時便能被激活。此外请唱，種群感知與控制可以用于改進(jìn)工程細(xì)胞療法弥咪，使細(xì)胞在特定的靶標(biāo)位置被激活。

教授介紹

Michael B. Elowitz為加州理工學(xué)院的教授十绑，也是霍華德·休斯醫(yī)學(xué)研究所的研究員聚至。他于1992年獲得加州大學(xué)伯克利分校學(xué)士學(xué)位，于1999年獲得普林斯頓大學(xué)博士學(xué)位本橙。Michael B. Elowitz所在課題組的主要研究方向是遺傳學(xué)和分子生物學(xué)扳躬。他的團(tuán)隊試圖通過生物通訊系統(tǒng)編碼細(xì)胞行為，其研究成果發(fā)表在Science甚亭、Nature贷币、PNAS等期刊上。2007年因設(shè)計基因調(diào)控通路“Repressilator”亏狰，獲得了麥克阿瑟天才獎役纹。

參考文獻(xiàn)

Ma Y, Budde MW, Mayalu MN, et al.Synthetic mammalian signaling circuits for robust cell population control.Cell. 2022; S0092-8674(22)00137-4. doi:10.1016/j.cell.2022.01.026