前期記錄
先確定目標(biāo)基因
CRISPR/Cas9基因敲除實(shí)驗(yàn)全記錄（1）
然后對(duì)目的基因進(jìn)行背景調(diào)查
CRISPR/Cas9基因敲除實(shí)驗(yàn)全記錄（2）磨刀不誤砍柴工
設(shè)計(jì)sgRNA及引物
CRISPR-Cas9（三）--sgRNA設(shè)計(jì)好之后
CRISPR/Cas9基因敲除實(shí)驗(yàn)全記錄（3）sgRNA及引物設(shè)計(jì)
讀者補(bǔ)充
上次推文我針對(duì)sgRNA設(shè)計(jì)方面增加了一部分內(nèi)容争便，有一位特別棒的讀者（簡(jiǎn)書名：chuxinxzz）在下方給我留言說可以使用Cas9+sgRNA切割效率試劑盒驗(yàn)證切割效率任洞，并且經(jīng)實(shí)踐得知，驗(yàn)證結(jié)果和實(shí)際編輯結(jié)果相差無幾祖驱。感謝他給我的補(bǔ)充，這也是我寫下去的動(dòng)力羡微，畢竟我一個(gè)人的精力是有限的宫莱，因此不論我好與壞，我都先把自己拎出來题诵，以期待得到其他人的交流和答復(fù)，從而學(xué)到更多的經(jīng)驗(yàn)层皱。
昨天和今天
昨天我依照golden gate assembly的方法性锭，參照了張峰老師實(shí)驗(yàn)室protocol，使用了BbsI限制性內(nèi)切酶和T4連接酶叫胖，將合成好的sgRNA插入到帶有Cas9的質(zhì)粒中草冈；接著轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞中--復(fù)蘇感受態(tài)細(xì)胞后--涂氨芐西林平板過夜培養(yǎng)--今天傍晚挑取單克隆菌落置于氨芐西林+LB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，明日即可提取質(zhì)粒并酶切驗(yàn)證瓮增。但由于293FT細(xì)胞凍存于液氮罐中怎棱，今日打臺(tái)風(fēng)沒有來得及復(fù)蘇該細(xì)胞，因此轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)有拖后绷跑。
下一步
質(zhì)粒小提試劑盒
酶切實(shí)驗(yàn)使用到的相關(guān)限制性內(nèi)切酶（BbsI）
準(zhǔn)備好293FT細(xì)胞（應(yīng)提前準(zhǔn)備拳恋，一旦酶切驗(yàn)證成功，立即轉(zhuǎn)染篩選）砸捏，也就是在這一步谬运，可以使用上文提到的讀者建議用的酶切效率試劑盒隙赁。如此看來，可以節(jié)約下至少4-6天的時(shí)間梆暖，當(dāng)真是好辦法的伞访。
感謝師兄DZ
