大家好宜咒，今天和大家分享的是四月份發(fā)表在Cancers (Basel)(IF：6.162)雜志上的一篇文章，“Genetic and Immune Changes Associated with Disease Progression under the Pressure of Oncolytic Therapy in A Neuroblastoma Outlier Patient”把鉴，文章中作者通過(guò)對(duì)一個(gè)采用了病毒溶瘤治療后的難治性神經(jīng)母細(xì)胞瘤的患者穩(wěn)定期和進(jìn)展期的腫瘤樣本進(jìn)行了測(cè)序故黑。通過(guò)對(duì)測(cè)序結(jié)果的分析，作者認(rèn)為在演化過(guò)程中庭砍，腫瘤細(xì)胞在T細(xì)胞應(yīng)答的腫瘤微環(huán)境中逐漸獲得了對(duì)病毒療法的抗性场晶。
Genetic and Immune Changes Associated with Disease Progression under the Pressure of Oncolytic Therapy in A Neuroblastoma Outlier Patient
神經(jīng)母細(xì)胞瘤離群患者在溶瘤治療壓力下與疾病進(jìn)展相關(guān)的遺傳和免疫變化
https://www.bilibili.com/video/BV1xf4y127UX
一、研究背景
作者團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)了一種關(guān)于癌癥的新治療策略（Celyvir）：通過(guò)使用自體骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）反復(fù)靜脈內(nèi)給藥怠缸，以提供溶瘤腺病毒（ICOVIR-5）[一種經(jīng)過(guò)改造的腺病毒]來(lái)治療晚期癌癥患者诗轻。
由于對(duì)于此項(xiàng)治療方法的臨床經(jīng)驗(yàn)很少，作者希望通過(guò)研究患者的信息獲得藥物動(dòng)力學(xué)等方面的信息揭北，并了解腫瘤中的病毒復(fù)制如何激活抗腫瘤免疫反應(yīng)及對(duì)腫瘤免疫學(xué)的影響扳炬，包括腫瘤浸潤(rùn)性免疫細(xì)胞和腫瘤微環(huán)境。
二搔体、研究思路
三恨樟、結(jié)果解析
1、溶瘤病毒療法在腫瘤進(jìn)化過(guò)程中浸潤(rùn)性免疫細(xì)胞的景觀
作者對(duì)接受最大溶瘤病毒劑量（70dose）的患者進(jìn)行了深入表征：
為了確定溶瘤病毒治療壓力下腫瘤演變的生物學(xué)特征疚俱，使用不同的算法分析了在治療過(guò)程中穩(wěn)定期和進(jìn)展期時(shí)從腫瘤樣品中獲得的RNA-Seq數(shù)據(jù)劝术，作者發(fā)現(xiàn)，與疾病進(jìn)展期相比呆奕，穩(wěn)定期更易被免疫細(xì)胞浸潤(rùn)养晋。
使用ESTIMATE（使用表達(dá)數(shù)據(jù)，估計(jì)惡性腫瘤組織中基質(zhì)細(xì)胞和免疫細(xì)胞的含量）評(píng)估腫瘤組織中浸潤(rùn)的基質(zhì)/免疫細(xì)胞的存在
在疾病的兩個(gè)階段梁钾，免疫評(píng)分（p = 0.0025）和基質(zhì)評(píng)分（p = 0.06绳泉，圖1A）之間都存在主要差異。
圖1A.ESTIMATE 評(píng)分結(jié)果
Immunophenoscore（一種衡量腫瘤總體免疫原性的指標(biāo)）在穩(wěn)定期評(píng)分高于進(jìn)展期（p = 0.0005陈轿，圖1B）圈纺。
圖1B.Immunophenoscore 評(píng)分結(jié)果
MCPcounter軟件獲得有關(guān)特定細(xì)胞譜系滲透的信息（圖1C）
B淋巴細(xì)胞（得分3.5 vs.0.5; p = 0.0000003）秦忿， T淋巴細(xì)胞（得分2.2 vs. 1.8; p = 0,0007）麦射，CD8 陽(yáng)性T細(xì)胞（得分3 vs. 2.8; p = 0.0313），NK淋巴細(xì)胞 （得分0.6 vs. 0.55; p = 0.0241）灯谣，髓樣樹(shù)突狀細(xì)胞（得分1.8 vs 1.1; p = 0,0002）
相比之下潜秋，與穩(wěn)定期相比，單核細(xì)胞在進(jìn)展期中的數(shù)量明顯更多（得分3.2 vs. 2.9胎许；p = 0,0005）
與穩(wěn)定期相比峻呛，進(jìn)展期內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的分?jǐn)?shù)較低
圖1C.MCPcounter結(jié)果罗售，顯示兩個(gè)腫瘤樣本存在大量不同的免疫亞群
免疫種群的估計(jì)使用QuanTIseq算法進(jìn)行（補(bǔ)充圖S1）
與進(jìn)展期相比，穩(wěn)定期存在更多的B細(xì)胞（p = 0.011）钩述，樹(shù)突狀細(xì)胞（p = 0.024）寨躁，NK細(xì)胞（p = 0.026）和T淋巴細(xì)胞（p <0.05）
在穩(wěn)定期中M2巨噬細(xì)胞的豐度顯著更高（p = 0.023），Treg的豐度也有更高的趨勢(shì)（p = 0.069）這與發(fā)炎少和腫瘤前期的腫瘤微環(huán)境經(jīng)典相關(guān)牙勘。
補(bǔ)充圖1.QuanTiSeq預(yù)測(cè)的兩個(gè)疾病階段的免疫表型
通過(guò)CIBERSORT估算每個(gè)樣品中22種免疫細(xì)胞亞型的相對(duì)豐度（圖1D）
B淋巴細(xì)胞（幼稚B細(xì)胞和記憶B細(xì)胞）為疾病穩(wěn)定期中的主要細(xì)胞群职恳。同時(shí)M2巨噬細(xì)胞是髓樣細(xì)胞中的主要亞群
在疾病進(jìn)展期，漿細(xì)胞似乎是B淋巴細(xì)胞的主要成分方面，而CD8在腫瘤浸潤(rùn)性T淋巴細(xì)胞（TIL）中占主導(dǎo)地位放钦。活化的NK淋巴細(xì)胞在此時(shí)也表現(xiàn)出更多的代表性恭金，而M2巨噬細(xì)胞在髓樣細(xì)胞群中占主導(dǎo)地位操禀，并且隨著M0和M1巨噬細(xì)胞的的總比例增加。
圖1D.CIBERSORT分析結(jié)果横腿，顯示不同的免疫細(xì)胞亞群的比例
總而言之颓屑，所有分析的結(jié)果表明，在疾病的穩(wěn)定期蔑水，適應(yīng)性免疫細(xì)胞的較高的浸潤(rùn)和活性主導(dǎo)著免疫格局邢锯，腫瘤進(jìn)展期時(shí)，免疫浸潤(rùn)細(xì)胞群更明顯地趨向于先天免疫細(xì)胞的存在搀别。
此外丹擎，作者在數(shù)據(jù)集中研究了腫瘤進(jìn)化過(guò)程中的趨化因子表達(dá)譜變化。發(fā)現(xiàn)該變化可能與已經(jīng)描述的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)中發(fā)現(xiàn)的差異有關(guān)歇父。（圖二）
在穩(wěn)定期：
與B淋巴細(xì)胞趨化性相關(guān)的基因（CCL [C-C配體] 19蒂培，CCL21，CXCL [C-X-C]配體] 12和CXCL13）的基因表達(dá)明顯更高榜苫。
已知的淋巴細(xì)胞（CCL19护戳，CCL20，CCL21和CCL22）和DC（CXCL12）趨化因子在疾病穩(wěn)定期也以明顯更高的水平表達(dá)
在進(jìn)展期：
募集骨髓細(xì)胞（CCL3垂睬，CCL4媳荒，CCL5），Treg（CCL4）和活化T的趨化因子驹饺。淋巴細(xì)胞（CXCL9钳枕，CXCL10和CXCL11）以明顯更高的水平表達(dá)
圖2.熱圖顯示在疾病的不同階段，不同組趨化因子的相關(guān)性和豐度
2赏壹、腫瘤進(jìn)化過(guò)程中的腫瘤浸潤(rùn)性的T淋巴細(xì)胞相關(guān)分析
作者對(duì)腫瘤浸潤(rùn)性T淋巴細(xì)胞進(jìn)行了分析鱼炒，T細(xì)胞受體（TCR）β鏈基因分析的深度測(cè)序表明：
在進(jìn)展期中，來(lái)自腫瘤樣本的克隆重排數(shù)量更高（圖3A）
圖3A.疾病的兩個(gè)階段的T細(xì)胞受體（TCR）克隆重排
進(jìn)展期間蝌借，與序列庫(kù)相關(guān)的10個(gè)最豐富的重排的相對(duì)頻率也較高（補(bǔ)充表S1）
這表明在疾病發(fā)展過(guò)程中昔瞧，TIL的浸潤(rùn)更加多樣化指蚁，在進(jìn)展時(shí)占主導(dǎo)地位的克隆較少。
附表1.每個(gè)腫瘤樣品的十種最常見(jiàn)的重排
穩(wěn)定期發(fā)現(xiàn)的10個(gè)最豐富的重排中在進(jìn)展期仍可以被觀察到自晰。
圖3B.重排保存情況
隨后凝化，作者分析了與T淋巴細(xì)胞激活相關(guān)的基因的表達(dá)水平。結(jié)果顯示：
T淋巴細(xì)胞在進(jìn)展期：
表達(dá)較高水平的顆粒酶（GZMA酬荞，GZMB）和穿孔素（PRF1）基因（圖4A）缘圈，以及與慢性激活相關(guān)的標(biāo)志物（HAVCR2，LAG3和TIGIT）（圖4B）
圖4AB.細(xì)胞毒性T細(xì)胞活性及免疫監(jiān)視相關(guān)分子
通過(guò)定量PCR檢測(cè)與細(xì)胞衰竭相關(guān)的T細(xì)胞受體（HAVCR2 / TIM3袜蚕，LAG3和PD1）以及它們中兩個(gè)最常見(jiàn)的配體（HMGB1和CEACAM糟把，HLA-DR和LSECTIN ， PDL1和PDL2）牲剃，以及TGFβ的三個(gè)已知同工型（TGFB1遣疯，TGFB2和TGFB3）發(fā)現(xiàn)
與穩(wěn)定期相比，進(jìn)展期的微環(huán)境顯示PD1受體的配體（PDL1和PDL2）的表達(dá)水平明顯更高凿傅。LAG3受體在進(jìn)展過(guò)程中也明顯過(guò)表達(dá)缠犀，但其兩個(gè)配體（HLA-DR和LSECTIN）被顯著下調(diào)（圖4C）
附圖3.T細(xì)胞衰竭和免疫監(jiān)視相關(guān)的分子
????????此外，作者使用GSVA（基因組變異分析）分析了疾病期間激活的遺傳和分子程序聪舒。研究發(fā)現(xiàn)
在穩(wěn)定期辨液，半胱天冬酶/凋亡途徑和細(xì)胞周期活化較高（補(bǔ)充圖S2）
附圖2.與兩個(gè)疾病階段的細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期有關(guān)的基因組和分子途徑及過(guò)程。
3箱残、腫瘤進(jìn)化過(guò)程中的突變和新表位景觀
作者根據(jù)全外顯子測(cè)序數(shù)據(jù)滔迈，對(duì)腫瘤樣品序列變異進(jìn)行分析，作者發(fā)現(xiàn):
進(jìn)展期發(fā)現(xiàn)的序列變異總數(shù)高于穩(wěn)定期檢測(cè)到的序列變異總數(shù)被辑，分別為169個(gè)和101個(gè)燎悍。
總體而言，兩個(gè)樣品共有55個(gè)單核苷酸變異
作者使用了CONDEL軟件鑒定具有假定功能影響的遺傳突變盼理，表1列出了僅在腫瘤進(jìn)展期出現(xiàn)的突變谈山。
表1.CONDEL預(yù)測(cè)的進(jìn)展階段突變列表 作者對(duì)全外顯子測(cè)序數(shù)據(jù)中對(duì)癌癥體細(xì)胞突變目錄（COSMIC）突變特征進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示宏怔，不同樣品中的遺傳特征存在差異奏路。（圖5B，表2）
表2.定量DNA堿基后臊诊，在兩個(gè)腫瘤樣品中檢測(cè)到的突變signature
圖5B.兩種腫瘤樣品中與不同類型癌癥相關(guān)的不同突變signature情況
與進(jìn)展期相比鸽粉，穩(wěn)定期的signature變異更大。但進(jìn)展期的相對(duì)signature豐度更大
結(jié)果中的signature18與神經(jīng)母細(xì)胞瘤經(jīng)典相關(guān)妨猩，并在疾病進(jìn)展期出現(xiàn)潜叛；
signature2在穩(wěn)定期出現(xiàn)秽褒，與多種癌癥相關(guān)壶硅，并且與激活A(yù)ID / APOBEC脫氨酶相關(guān)威兜。
圖5C.兩個(gè)腫瘤樣品中每個(gè)堿基對(duì)的豐度
隨后作者對(duì)每個(gè)腫瘤樣本檢測(cè)到的HLA單核苷酸變異體（SNV）的存在進(jìn)行研究，預(yù)測(cè)新表位庐椒，分析結(jié)果表明椒舵。
與穩(wěn)定期相比，進(jìn)展期中腫瘤中新表位候選物的負(fù)載更高约谈，分別為18和5笔宿。
疾病穩(wěn)定期中發(fā)現(xiàn)的所有5個(gè)候選物也在進(jìn)展期被檢測(cè)到。
表3.疾病兩個(gè)階段的新表位詳細(xì)預(yù)測(cè)及穩(wěn)定期表位預(yù)測(cè)
表4.進(jìn)展期表位預(yù)測(cè)
在確定了候選表位后棱诱，作者對(duì)抗原加工及呈遞相關(guān)基因的完整性進(jìn)行了研究泼橘。
RNA-seq分析表明抗原加工和呈遞的相關(guān)表達(dá)沒(méi)有缺陷，與穩(wěn)定期相比迈勋，大部分相關(guān)基因在進(jìn)展期中有更高的表達(dá)（圖6）
新表位可以在腫瘤進(jìn)化過(guò)程中的任意階段在HLA分子中表達(dá)
圖6.包含HLA抗原在內(nèi)的抗原加工呈遞相關(guān)基因在不同疾病時(shí)期表達(dá)
小結(jié)
在這篇文章中炬灭，作者通過(guò)對(duì)施加了新療法后單例腫瘤患者的穩(wěn)定期及進(jìn)展期兩組樣本進(jìn)行研究，通過(guò)RNA測(cè)序靡菇，全外顯子測(cè)序以及TCR測(cè)序來(lái)獲得腫瘤在不同時(shí)期的免疫相關(guān)信息：作者首先使用多種算法對(duì)RNA測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行了免疫指標(biāo)相關(guān)評(píng)分重归，揭示了各階段中免疫細(xì)胞種群組成及豐度，并研究了腫瘤進(jìn)化過(guò)程中趨化因子表達(dá)的差異厦凤；隨后鼻吮，作者使用TCR測(cè)序?qū)δ[瘤浸潤(rùn)的T細(xì)胞突變進(jìn)行分析，對(duì)該病例中TCR受體的基因重排進(jìn)行深入研究较鼓。通過(guò)定量PCR對(duì)與T細(xì)胞衰竭相關(guān)的T細(xì)胞受體及配體進(jìn)行檢測(cè)椎木，探究在T細(xì)胞衰竭對(duì)腫瘤進(jìn)展的作用。GSVA指示疾病過(guò)程中T細(xì)胞凋亡以及細(xì)胞周期基因的活化表達(dá)博烂；作者最后通過(guò)全外顯子測(cè)序?qū)δ[瘤樣品中的序列變異進(jìn)行了分析拓哺，并使用CONDEL軟件鑒定具有假定功能影響的遺傳突變，針對(duì)COSMIC的突變特征進(jìn)行了分析脖母，根據(jù)HLA中檢測(cè)出的SNV進(jìn)行新表位預(yù)測(cè)士鸥。
還是和往常一樣，后臺(tái)回復(fù)「59a」谆级，即可獲取今天小編為大家解讀的文獻(xiàn)烤礁。本期的分享就到這里啦，一起期待下一期的精彩分享吧~
