腫瘤突變負荷（Tumor Mutation Burden卿操，TMB // Tumor Mutation Load（TML））是一種新發(fā)現(xiàn)的可量化的臨床指標掠械，有望用來預測腫瘤對腫瘤免疫治療的反應。研究發(fā)現(xiàn)：TMB越高的病人，對腫瘤免疫治療的效果越好觉增。
具體來說， TMB就是腫瘤組織每兆堿基中突變的總數(shù)介褥。通俗的講，就是腫瘤基因的突變密度仇味，也就是腫瘤基因組中平均有多少突變呻顽。想象一下，整個基因組就是一個龐大的密碼庫丹墨，一些密碼遁世望塵無所事事廊遍，一些密碼勤勤懇懇地掌管著你的細胞、組織的生老病死贩挣。
突變喉前，就是說密碼在遺傳或環(huán)境等因素的作用下出現(xiàn)了變換，可能是A變成B王财，也可能少了C整個隊列都錯位等卵迂。正常人也有一定的突變，但一般數(shù)目相對較少且多數(shù)被修正绒净，或者發(fā)生在那些無所事事無傷大雅的地方见咒。
腫瘤的發(fā)生發(fā)展，很多時候和基因在重要的編碼序列發(fā)生突變相關挂疆。腫瘤突變負荷改览，TMB，就是這個密碼庫單位區(qū)域中發(fā)生錯誤的密碼總量缤言。一定程度上可以理解成單位區(qū)域內(nèi)發(fā)生變換的密碼總量越大宝当，腫瘤突變負荷（TMB）越高，那么可能相應的腫瘤相關的致癌突變越多胆萧，每個腫瘤的個性就越突出庆揩，越不同于正常細胞。
我們的免疫系統(tǒng)就是志在清除異已跌穗，而腫瘤免疫治療的精髓就是通過各種方法喚起订晌、加強機體的免疫系統(tǒng)對腫瘤的殺傷。這種情況下蚌吸，腫瘤突變負荷越大锈拨，即TMB越高，腫瘤越個性迥異于正常套利，越容易成為腫瘤免疫的靶子推励，從而理論上講越有可能對免疫治療有效——說白了，突變越多的癌細胞肉迫，越不像正常細胞验辞，越容易被免疫細胞發(fā)現(xiàn)。
正常細胞都是白旗飄飄宣告免戰(zhàn)喊衫，而腫瘤TMB越高跌造，就意味著舉著越多的紅旗在白旗的海洋里招搖過世，隨時招致免疫細胞來炮轟族购。所以壳贪，TMB越高的腫瘤病人對于免疫反應的效果越好。現(xiàn)在已知：高TMB可以幫助預測腫瘤免疫治療在肺癌寝杖、膀胱癌违施、黑色素瘤病人中的療效。
PD-1/PD-L1抗體在有大量TMB的肺癌中療效顯著優(yōu)于低TMB的肺癌瑟幕，前者的無進展生存時間是后者的4倍多磕蒲！高TMB的膀胱癌患者，對PD-1/PD-L1抗體的反應更好只盹。在接受CTLA-4抗體辣往，免疫治療的黑色素瘤的病人，高TMB的病人和低TMB病人相比殖卑，總生存時間延長3.5年站削！大家可以看到TMB在預測腫瘤免疫的治療反應方面的喜人成果。
那么如何測定TMB呢孵稽？怎么知道腫瘤突變負荷的高低许起？現(xiàn)在的方法是全面的基因組分析，備選的方案有：全基因組測序肛冶、全外顯子測序和選擇性基因測序街氢。因為是新興的預測指標，目前沒有統(tǒng)一的方式睦袖。對于現(xiàn)在很火熱的PD-1免疫抗體來說珊肃，有效率的問題一直不高，雖然有PD-L1陽性作為參考馅笙，但在1%伦乔，大于5%和大于50%三種情況下，也并不是正比關系董习；同樣由于對PD-L1檢測的免疫組化方法不同烈和，表達標準也不一致。是否還有更適合的檢測指標能提高PD-1抗體的有效率呢皿淋？
TMB能夠預估免疫治療的療效
2017年ASCO年會有報道稱：高TMB的患者（腫瘤基因的突變密度高的患者）招刹，無疾病進展期 (PFS)相比化療的生存期長恬试。研究發(fā)現(xiàn)：TMB越高的病人，對腫瘤免疫治療的效果越好》枋睿現(xiàn)代醫(yī)學中發(fā)現(xiàn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展训柴，很多時候和基因在重要的編碼序列發(fā)生突變相關。腫瘤突變負荷（TMB）妇拯，就是基因中發(fā)生錯誤的密碼總量幻馁。腫瘤突變負荷（TMB）越高，那么可能相應的腫瘤相關的致癌突變越多越锈，每個腫瘤的個性就越突出仗嗦，越不同于正常細胞。腫瘤免疫治療的原理就是通過加強機體免疫系統(tǒng)對腫瘤的識別和殺傷甘凭。而腫瘤突變負荷越大（TMB越高）稀拐，突變越多的癌細胞，越不像正常細胞对蒲，越容易被免疫細胞發(fā)現(xiàn)钩蚊。自然無法逃脫免疫系統(tǒng)的追殺。現(xiàn)在已知：高TMB可以幫助預測腫瘤免疫治療在肺癌蹈矮、膀胱癌砰逻、黑色素瘤病人中的療效。PD-1/PD-L1抗體在有大量TMB的肺癌中療效顯著優(yōu)于低TMB的肺癌泛鸟，前者的無進展生存時間是后者的4倍多蝠咆！高TMB的膀胱癌患者，對PD-1/PD-L1抗體的反應更好北滥。在接受CTLA-4抗體刚操，免疫治療的黑色素瘤的病人，高TMB的病人和低TMB病人相比再芋，總生存時間延長3.5年菊霜！
PD-L1
首先我們先了解一下什么是PD-L1，PD-L1是一種表達于細胞表面的蛋白济赎，又稱B7-H1蛋白鉴逞，是由CD274基因編輯表達。它可以與效應T細胞上的PD-1及B7.1結(jié)合司训，傳導免疫抑制信號构捡，抑制免疫效應T細胞的活性。PD-L1在許多類型的細胞中表達壳猜，包括胎盤勾徽、血管內(nèi)皮細胞、胰島細胞统扳、肌肉喘帚、肝細胞畅姊、上皮細胞、間充質(zhì)干細胞吹由，以及B細胞涡匀，T細胞，樹突狀細胞溉知，巨噬細胞，肥大細胞腕够。而PD-L1在腫瘤細胞表面的表達則成為了腫瘤逃脫免疫細胞追殺造成腫瘤生長的驅(qū)動因素级乍。
PD-L1在腫瘤細胞的表達機制有兩種，組成性廣泛（固有）表達和適應性聚焦表達帚湘。固有表達是因為致癌基因信號通路改變引起的PD-L1的組成性表達玫荣，表達恒定。適應性聚焦表達是在免疫細胞分泌的促炎癥因子如IFN-γ的作用下表達大诸，是動態(tài)變化的捅厂。這兩種表達機制不排斥，PD-L1的固有表達可在炎癥因子作用下表達上調(diào)资柔。
基于以上機理焙贷， PD-L1的檢測是基于細胞蛋白水平的檢測，因此臨床試驗中以免疫組化方法為主贿堰。也就是大家在手術或穿刺后取得的腫瘤組織進行切片染色辙芍，通常在病理報告中顯示。免疫組化是檢測蛋白表達的經(jīng)典手法羹与，其通過抗體著色后由病理醫(yī)師鏡下觀察根據(jù)著色深淺來評價表達情況故硅。因此除了染色技術外，抗體的特異性也尤其重要纵搁。而目前我國PD-L1檢測比較混亂吃衅，一是染色技術及條件的不統(tǒng)一；二是染色的抗體多樣腾誉；三是病理評價標準尚未統(tǒng)一徘层。這些都導致國內(nèi)患者檢測PD-L1的價值減低。
截至到目前妄辩，F(xiàn)DA已經(jīng)批準了4款PD-1/PD-L1抑制劑用于7類不同腫瘤的治療惑灵，下表列出批準的時間和基本適應癥（精準適應癥全稱請查閱FDA官方網(wǎng)站）。
目前市場上這四種單抗檢測是否具有可比性眼耀，是否可以通用英支？檢測技術是IHC，一種儀器是Ventana哮伟，一種是Dako干花，而且評價細胞有腫瘤細胞和腫瘤浸潤免疫細胞妄帘，因此在評價免疫治療時要考慮單抗藥物、檢測方法池凄、cutoff值等信息÷胀眨現(xiàn)在，50%高表達僅限于默沙東的檢測方法肿仑，至于是否與其他方法通用致盟，目前缺乏循證醫(yī)學證據(jù)。
羅氏單抗藥物是Atezolizumab尤慰，靶點PD-L1馏锡，PD-L1 ICH檢測使用Ventana SP142，評價的細胞是腫瘤細胞和腫瘤浸潤免疫細胞伟端，cutoff值定為1%杯道、5%、50%责蝠。III期OAK研究顯示党巾，PD-L1高表達人群傾向于從Atezolizumab治療中獲得更大的OS獲益，而且隨著表達率的增高霜医，獲益更大齿拂；在PD-L1陰性亞組中，Atezolizumab相比多西他賽未能提高ORR肴敛。
施貴寶的Nivolumab靶點PD-1创肥，檢測使用Dako28-8，cutoff值是1%值朋、5%叹侄。III期CheckMate057研究顯示，PD-L1的表達水平與非鱗NSCLC患者從Nivolumab治療的OS獲益呈正相關昨登。III期CheckMate017研究顯示趾代，Nivolumab在鱗癌患者中的療效與PD-L1的表達水平無關。
第三個是Pembrolizumab單抗丰辣，靶點PD-1撒强，PD-L1IHC檢測使用Dako 22C3，評價的是腫瘤細胞笙什，cutoff值是1%飘哨、50%。III期KEYNOTE010研究顯示琐凭，PD-L1高表達人群接受Pembrolizumab治療后死亡風險下降更多芽隆。PD-L1表達對Pembrolizumab至關重要，PD-L1強陽性的患者甚至可以一線使用。
如何定義表達率
PD-L1檢測受人詬病的地方之一是缺乏標準胚吁。已經(jīng)獲批或正在研究中的抗PD-1治療牙躺，包括atezolizumab和durvalumab都有自己配套的PD-L1檢測。但問題是腕扶，每種檢測所用到的抗體和具體技術都不同孽拷，導致PD-L1陽性的定義只對應于藥企自己的標準。比如雖然所有的檢測都分析了腫瘤細胞的PD-L1染色情況半抱，但atezolizumab同時需要評估免疫浸潤細胞的PD-L1狀態(tài)脓恕。針對檢測標準的問題，包括國際肺癌研究協(xié)會在內(nèi)的多個國際組織都在努力推進不同PD-L1表達檢測技術分析窿侈，以期能夠提供不同檢測間可靠的精密度對比數(shù)據(jù)进肯。
在臨床試驗中， Keytruda及opdivo定義了PD-L1表達的統(tǒng)計標準棉磨，主要以百分比為標尺，即在至少有100個腫瘤細胞的癌巢中学辱，表達PD-L1的腫瘤細胞占癌巢腫瘤細胞的比例乘瓤，因此出現(xiàn)了PD-L1表達的百分比之說。下圖即是PD-L1表達量1%策泣、1%-49%衙傀、50%的不同鏡下圖，黃色為著色部位即表達PD-L1的細胞萨咕。（ABC為低倍鏡下统抬，DEF為高倍鏡下）。
而atezolizumab治療NSCLC的臨床試驗中危队，他們將檢測點不只局限在腫瘤細胞的PD-L1表達上還同時評價了腫瘤環(huán)境中浸潤的免疫細胞上PD-L1的表達情況聪建，即采用了TC及IC兩個標準，試驗結(jié)束茫陆，兩個預測指標對療效都有獨立預測價值金麸。這主要基于體內(nèi)的免疫細胞如調(diào)節(jié)T細胞也參與了免疫環(huán)境的調(diào)控。這也提示PD-L1的檢測存在很多分歧事宜簿盅。
1.3 PD-L1****檢測的問題與挑戰(zhàn)
PD-L1檢測存在的問題有：生物學方面挥下，如瘤間及瘤內(nèi)異質(zhì)性，干預治療影響表達桨醋，以及細胞類型棚瘟、染色部位等；檢測技術方面喜最，如不同的檢測抗體和平臺偎蘸，不同的閾值；組織來源方面，組織類型禀苦，原發(fā)部位與轉(zhuǎn)移灶蔓肯，細胞學標本，標本質(zhì)量等振乏。這些可能會干擾PD-L1的檢測結(jié)果蔗包，需要大量臨床研究進行證實。
美國AACR慧邮、IASLC和4家公司聯(lián)合制定了藍印計劃调限，目的就是比對四種單抗的檢測結(jié)果。藍印計劃在39個NSCLC標本比較4個試劑檢測的結(jié)果误澳，在染色方面耻矮，28-8、22C3忆谓、SP263顯示出相似的腫瘤細胞陽性染色百分比裆装，SP142染色陽性的腫瘤細胞較少；4種試劑在免疫細胞的染色上一致性較大倡缠；在臨床診斷方面哨免，4種試劑完全一致的只占19%。
德國的一致性研究顯示昙沦，4種試劑在腫瘤細胞染色之間的一致性較高琢唾，免疫細胞色一致性較差。
AZ比較研究對500例標本比較了28-8盾饮、SP263和22C3的腫瘤細胞染色采桃，結(jié)果顯示3種試劑之間的一致性較高。
2016年ESMO報告了迄今最大樣本量的NSCLC PD-L1檢測數(shù)據(jù)丘损，包括4784例NSCLC普办，研究得出4項結(jié)論：鱗癌和腺癌的表達分布相似；經(jīng)治和初治人群的表達分布相似徘钥；原發(fā)部位和轉(zhuǎn)移灶的表達分布相似泌豆；新鮮標本和存檔標本的表達分布相似。
FDA獲批的PD-1/PD-L1抑制劑對PD-L1的檢測要求吏饿，對于不同腫瘤根據(jù)不同的循證醫(yī)學證據(jù)批準踪危，如Nivolumab二線治療無需PD-L1表達檢測，但建議補充診斷猪落，Atezolizumab二線治療也不需要PD-L1表達檢測贞远，Pembrolizumab一線治療PD-L1≥50%，二線治療≥1%笨忌。
2****腫瘤突變負荷
從已經(jīng)批準的適應癥和關鍵臨床研究提供的證據(jù)來看蓝仲，PD-L1的表達是否可以指導臨床用藥，選擇獲益人群，結(jié)論目前還不一致袱结，這從另外一個側(cè)面提示PD-L1表達還不是一個完美的bio-marker亮隙。研究較多的潛在bio-marker 有腫瘤突變負荷（tumor mutation burden, TMB）、微衛(wèi)星高度不穩(wěn)定（microsatelliteinstability-high, MSI-H）和錯配基因修復缺失（mismatch-repair deficiency垢夹，MMR）溢吻，這些潛在的bio-marker又指向一個共同點突變相關新抗原（mutation-associated neoantigen）。抗CTLA-4在惡性黑色素瘤的研究與抗PD-1在NSCLC的研究進一步說明識別突變相關新抗原是引起自身抗腫瘤免疫反應的核心要素果元。
2.1****背景知識
腫瘤突變負荷（TMB）涉及到兩個重要概念germline mutation（種系突變或胚系突變）和somatic mutation（體細胞突變）促王，來自BioNinjia的圖解一目了然地詮釋二者的關系與區(qū)別。胚系突變來自上一代而晒，可以遺傳蝇狼，比如血友病，鐮刀細胞貧血等倡怎。
Somatic突變?yōu)楂@得性突變迅耘，在誘變劑的影響下發(fā)生突變，可表現(xiàn)在RNA和蛋白水平监署，產(chǎn)生的新抗原（或新表位）颤专、蛋白片段、肽段等被自身免疫系統(tǒng)識別為非自我（non-self）抗原焦匈，激活T細胞，引起免疫反應昵仅。
體細胞突變可能受到外源性誘變因素的影響缓熟，比如肺癌中煙草（吸煙）誘導的C→A的突變。惡性黑色素瘤中摔笤，紫外線照射引起的C→T的突變够滑。內(nèi)源性因素引起的突變可以是DNA錯配修復突變，比如結(jié)直腸癌和食管癌中的MSI（微衛(wèi)星不穩(wěn)定）吕世。在實體腫瘤中彰触，95%的突變?yōu)閱蝹€堿基的替換，造成的非同義突變（一個核苷酸突變改變一個蛋白的氨基酸順序）命辖，錯義突變（非同義點突變况毅，單個核苷酸改變導致一個密碼子編碼一個不同的氨基酸）和無義突變（非同義點突變使一個密碼子變?yōu)榻K止密碼子引起多肽鏈合成提前終止），共同構成了體細胞非同義突變的基本要素尔艇。
2.2 TMB****定義：
全基因組中計入胚系DNA變體后體細胞突變數(shù)目尔许。比如Lawrence,MS團隊在Nature上發(fā)表的研究中，將超過100個突變/Mb稱之為高TMB终娃。
2.3****臨床研究
Tumor Mutation Burden 指導臨床研究并已經(jīng)取得的成果味廊，突變負荷越高，治療應答越好，有時腫瘤類型更復雜余佛、腫瘤突變負荷更高的癌癥患者治療應答會更好柠新，這聽起來可能有點不可思議。
抗PD1和抗程序性死亡配體（PD-L1）檢查點抑制劑可能有助于激活高腫瘤突變負荷癌癥患者的免疫系統(tǒng)辉巡，如果你體內(nèi)存在大量腫瘤新抗原恨憎，一旦重新激活你的免疫系統(tǒng)，它就有東西可抗擊红氯。
在初始驗證和驗證組（共65名患者）框咙，對比治療無響應的患者，對治療有響應的患者都具有較高的突變負荷痢甘。此外喇嘱，高突變負荷組對比中、低突變負荷組塞栅，在客觀反應率者铜、無進展生存期和總生存期中均較高。
免疫療法應答表
腫瘤突變負荷免疫療法應答率（%）
低4
中等26
高45
非常高67
2.4 TMB****成為****bio-marker****的優(yōu)點與局限
TMB可以橫跨多個腫瘤進行橫向分析放椰；可潛在甄別具體的突變模式和推測新抗原負荷作烟；高覆蓋特點可以檢測出罕見的體細胞突變；高通量分析可以為已知驅(qū)動突變（比如砾医，EGFR,ALK拿撩，ROS1等）；TMB可以量化如蚜；可以用于選擇IO治療高獲益人群压恒。
TMB分析技術要求高和時間密集；NGS（如全外顯子組測序）價格昂貴错邦，醫(yī)保挑戰(zhàn)探赫；數(shù)據(jù)復雜需要生物信息學專家解讀；面臨的NGS技術挑戰(zhàn)有撬呢，石蠟包埋組織DNA/RNA降解伦吠；TMB需要有更多的臨床證據(jù)說明與免疫檢查點抑制劑療效之間的關系；TMB作為潛在的bio-marker魂拦，cut off需要定義毛仪。
總而言之，TMB是潛在的預測IO療效的bio-marker芯勘；NGS（next generation sequencing）可以用于檢測TMB（選項有全基因組測序潭千、全外顯子組測序和選擇性基因測序）；高TMB已經(jīng)被證明與CTLA-4抑制劑治療黑色素瘤和PD-1/PD-L1抑制劑治療黑色素瘤借尿、膀胱癌和NSCLC的臨床療效相關刨晴；TMB作為潛在IO biomarker的臨床研究正在進行中屉来，需要探索與PD-L1表達和腫瘤免疫微環(huán)境因素之間的關系。
2.5****如何檢測腫瘤突變負荷
TMB（腫瘤突變負荷）是一項新興的診斷方式狈癞，可以幫助預測免疫治療在某些腫瘤中的響應茄靠，例如肺癌、膀胱癌和黑色素瘤蝶桶。
美國Foundation和范德寶大學的合作者已經(jīng)公布了使用TMB的最新數(shù)據(jù)支持慨绳，作為foundation one全面的基因組分析的一部分，是全球唯一可以幫助預測PD-1/L1的治療效果的檢測真竖。這項結(jié)果將會添加到以往的證據(jù)中脐雪，來表明患者可以通過TMB預測免疫治療的獲益程度，這也讓我們更加接近讓最多的患者能從免疫治療中受益的目標恢共，為臨床醫(yī)生判定患者是否適合使用PD-1/PD-L1提供依據(jù)战秋。
目前，很多臨床研究都顯示讨韭，TMB可以預測免疫治療的療效脂信，如Nivomulab，Pembrolizumab和Atezolizumab透硝。但這些臨床試驗中采用不同的檢測平臺進行TMB檢測狰闪，且高TMB的cut-off值也各不相同。今后需要前瞻性的在臨床研究以及臨床實踐中濒生，探索和研究最佳的檢測方法和cut-off值埋泵。此外，PD-L1表達目前也是比較成熟的免疫預測指標罪治。TMB與PD-L1如何更好的聯(lián)合應用丽声，從而篩選最佳的免疫治療獲益人群，也是未來需要探索的重點规阀。
腫瘤的微環(huán)境非常復雜恒序，涉及到腫瘤細胞瘦麸、腫瘤微血管谁撼、免疫細胞以及腫瘤間質(zhì)等，他們之間的關系都需要進行明確的相關性研究滋饲，未來需要基于腫瘤微環(huán)境免疫特征的生物標記物研究厉碟。
