2009年，Hans Clevers及其團(tuán)隊(duì)成功利用小鼠腸道的成體干細(xì)胞培育出了第一個(gè)腸道類器官拥诡，從而揭開了類器官研究的新篇章触趴。類器官的培養(yǎng)過程涉及成體干細(xì)胞（TSCs）或多能干細(xì)胞（PSCs）在體外進(jìn)行3D培養(yǎng)，形成具有一定空間結(jié)構(gòu)的組織模擬物渴肉，其結(jié)構(gòu)和功能類似于真實(shí)器官冗懦，這有助于提高藥物研發(fā)的成功率。未來借助AI技術(shù)與類器官的聯(lián)合應(yīng)用仇祭，藥物篩選將變得更為高效和精準(zhǔn)披蕉。
眾所周知，人類大腦發(fā)育是一個(gè)復(fù)雜而精密的過程乌奇，不僅與神經(jīng)祖細(xì)胞大規(guī)模擴(kuò)張有關(guān)没讲，還需要同時(shí)建立一個(gè)多細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)。理論上礁苗，不斷擴(kuò)大的類器官可以直接從多個(gè)體組織細(xì)胞中生長爬凑，但到目前為止，腦類器官只能從多能干細(xì)胞中建立寂屏。2024年1月贰谣，類器官鼻祖Hans Clevers教授與Benedetta Artegian教授團(tuán)隊(duì)在CELL上聯(lián)合發(fā)表了“Human fetal brain self-organizes into long-term expanding organoids”一文。該研究直接從人胎兒腦組織中培育出體外自組織的大腦類器官迁霎，命名為FeBOs（Fetal brain in vitro self-organizes into organoids）吱抚。這種實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的類器官不僅創(chuàng)立了研究大腦發(fā)育的全新模式，還為深入探討大腦發(fā)育相關(guān)疾病考廉，如腦腫瘤的發(fā)展和治療秘豹，提供了有價(jià)值的新途徑。
首先昌粤，研究人員從人類胎兒腦組織中分離出神經(jīng)干細(xì)胞（NSCs）既绕，這些細(xì)胞以單層或3D細(xì)胞聚集物的形式生長啄刹；同時(shí)，若將組織切成小塊凄贩，并在無血清和無細(xì)胞外基質(zhì)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)誓军，也能形成有組織的3D結(jié)構(gòu)，稱之為胎兒衍生腦類器官（FeBOs）疲扎。超過95%的FeBOs系可通過切割整個(gè)類器官樣體進(jìn)行傳代昵时，每個(gè)切割片段都能重新形成完整的類器官樣體，提高了FeBOs系的可重復(fù)性椒丧，為下游應(yīng)用提供了穩(wěn)定的擴(kuò)增壹甥。隨后，研究人員利用標(biāo)志基因評估FeBOs的細(xì)胞組成壶熏，發(fā)現(xiàn)外圍富含神經(jīng)干/祖細(xì)胞（SOX2+）句柠，而中心則分布神經(jīng)元細(xì)胞（TUJ1+, DCX+, NeuN+）。細(xì)胞組成定量分析顯示棒假，F(xiàn)eBOs內(nèi)細(xì)胞的可再生豐度和異質(zhì)性溯职。通過慢病毒感染完整的FeBOs，研究人員評估了細(xì)胞系動力學(xué)淆衷，發(fā)現(xiàn)標(biāo)記細(xì)胞數(shù)量隨時(shí)間增加缸榄，支持正在進(jìn)行的神經(jīng)發(fā)生渤弛。此外祝拯，轉(zhuǎn)錄組分析還揭示了FeBOs獨(dú)特的神經(jīng)外胚層特征。
圖1?人胎兒腦自組織類器官的建立
為研究是否能夠培養(yǎng)具有人腦區(qū)域特異性的FeBOs她肯，檢驗(yàn)其在體外是否能保持內(nèi)在組織特性佳头，研究團(tuán)隊(duì)成功建立了背側(cè)和腹側(cè)FeBOs系，并通過qPCR檢測標(biāo)志物的表達(dá)晴氨。隨后康嘉，免疫熒光表征進(jìn)一步顯示了FeBOs的區(qū)域特異性，同時(shí)單細(xì)胞RNA測序分析也進(jìn)一步揭示了FeBOs與人胎兒腦組織細(xì)胞的相似性籽前。
圖2?FeBOs與人胎兒腦組織的細(xì)胞相似性
越來越多的證據(jù)表明亭珍，細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)和ECM-細(xì)胞相互作用在調(diào)節(jié)人類大腦發(fā)育中的特異性擴(kuò)張方面起著至關(guān)重要的作用。通過與蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)比較枝哄，他們發(fā)現(xiàn)大腦ECM關(guān)鍵成分在轉(zhuǎn)錄組-蛋白質(zhì)組表達(dá)上呈現(xiàn)出良好的一致性肄梨。分泌蛋白組的結(jié)果顯示，持續(xù)的組織完整性有助于生成ECM生態(tài)位挠锥，而ECM生態(tài)位可能反過來促進(jìn)FeBOs在組織結(jié)構(gòu)中的持續(xù)擴(kuò)張众羡，使研究人類大腦發(fā)育中的功能性ECM成為可能。
鑒于來源于組織的類器官具備迅速擴(kuò)張的潛力蓖租，研究團(tuán)隊(duì)深入研究了這些類器官在模擬腦癌方面的潛能粱侣。在本文中羊壹，研究團(tuán)隊(duì)利用NEPA21成功將piggyBac質(zhì)粒、CAG-EGFP質(zhì)粒齐婴、sgRNA質(zhì)粒和mCherry-Cas9質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至人胎兒腦類器官中油猫，實(shí)現(xiàn)了FeBOs的熒光標(biāo)記和基因編輯。結(jié)果顯示柠偶，經(jīng)過3個(gè)月的培養(yǎng)眨攘，具有TP53基因缺陷的細(xì)胞數(shù)量完全超過了類器官中的健康細(xì)胞，表明該FeBOs突變株具備癌細(xì)胞異常增殖的特性嚣州。這一研究提供了先進(jìn)的類器官模型鲫售，為深入了解大腦發(fā)育和相關(guān)疾病提供有力工具，對神經(jīng)科學(xué)研究和疾病治療具有重要意義该肴。
圖3 FeBOs支持穩(wěn)定的腫瘤建模
值得關(guān)注的是情竹，腫瘤類器官模型的建立依賴于穩(wěn)定、高效的轉(zhuǎn)染方法匀哄。有報(bào)告指出秦效，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑在腸道類器官中的轉(zhuǎn)染效率不足10%。逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)和慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)效率較高涎嚼，但是病毒隨機(jī)整合到宿主中具有潛在的誘變性阱州。電穿孔法不僅可以實(shí)現(xiàn)類器官60%或更高的轉(zhuǎn)染效率，同時(shí)也具備更高的生物安全性法梯。
自2015年起苔货，Hans Clevers教授及其合作團(tuán)隊(duì)便使用NEPA21進(jìn)行類器官轉(zhuǎn)染，至今已經(jīng)在腸道立哑、肝臟夜惭、乳腺組織、子宮內(nèi)膜和大腦等多種組織類器官中成功實(shí)現(xiàn)了基因轉(zhuǎn)染及編輯铛绰。
NEPA21電穿孔類器官體系及參數(shù)總結(jié)如下：
人胎兒腦類器官
人乳腺組織類器官
人胎兒肝臟類器官
人腸道類器官
圖4 類器官電穿孔基本流程
了解更多類器官電轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)操作及參數(shù)設(shè)置請來電咨詢或查閱NEPAGENE官網(wǎng)類器官應(yīng)用文獻(xiàn)：
https://nepagene.jp/en/applications/electroporation-e/cell-cultures-e/transfection-into-organoids-by-electroporation
參考文獻(xiàn)
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