2019-Feb-Week4 Intron-loss evolution of hatching enzyme genes in Teleostei
摘要
背景：孵化酶屬于蝦紅素金屬蛋白酶家族银舱，在胚胎孵化時能降解卵膜野来。在所有脊椎動物的基因組中都找到了孵化酶的同源基因。最近我們發(fā)現(xiàn)四足動物的孵化酶基因中外顯子－內含子結構序列是保守的，而硬骨魚中孵化酶基因經(jīng)常會丟失內含子匣摘。在硬骨魚類孵化酶基因中丟失內含子是一件稀有的進化事件怒医，因為眾所周知，真核生物基因一般都有內含子且不同種生物的內含子插入位點是保守的脆丁。在這里我們做的報告是經(jīng)過對硬骨魚類孵化酶基因中外顯子－內含子結構的廣泛研究得出了在進化過程中丟失內含子的原因及其如何丟失的世舰。
結果：我們對真骨魚總目27種孵化酶基因中內含子丟失的進化途徑進行了研究。低等硬骨魚孵化酶基因來自同一種類型槽卫，一個具有9－外顯子－8內含子結構的假定祖先跟压。另一方面，骨鰾下區(qū)魚（otocephalan）和純真骨魚（euteleost）有兩類孵化酶基因歼培，說明在骨鰾下區(qū)魚（otocephalan）和純真骨魚（euteleost）的共同祖先中存在基因復制現(xiàn)象震蒋。根據(jù)系統(tǒng)進化分析法這種重復基因可分為兩進化枝（clades I and II）。在骨鰾下區(qū)魚（otocephalan）和純真骨魚（euteleost）中躲庄，clade I基因發(fā)展為特殊的系統(tǒng)發(fā)生結構查剖，如8－外顯子－7－內含子，5－外顯子－4內含子噪窘，4－外顯子－3內含子或者是內含子缺失的結構笋庄。與clade I基因相反，clades II基因的結構相對穩(wěn)定倔监，而且與祖先基因相似直砂。表達分析顯示，與持家基因相比孵化酶基因是高表達基因浩习。比較clade I基因與clades II基因的表達水平静暂，clade I基因的表達量高于clades II基因。
結論：孵化酶基因在進化中丟失了內含子谱秽，內含子丟失事件發(fā)生在硬骨魚類系統(tǒng)發(fā)育的特殊位點籍嘹。我們認為在硬骨魚進化中高表達的孵化酶基因頻繁丟失內含子闪盔，而低表達的孵化酶基因保留著祖先基因的外顯子－內含子結構。
背景
真核生物的許多核心基因都是由編碼序列（外顯子）及散在的插入序列（內含子）組成的辱士。外顯子和內含子序列一起轉錄成mRNA前體泪掀，內含子通過拼接作用從mRNA前體中移除。真核生物同源基因的內含子插入位點被認為是非常保守的颂碘。然而异赫，最近對直系同源基因內含子位置的大量比對表明內含子位置比先前預測的更具有動態(tài)多樣性。在真核生物進化過程中報道有相當數(shù)量的內含子丟失和增加头岔。線蟲類有顯著高比例的內含子轉換塔拳。然而在脊椎動物中，被報道的直系同源的外顯子-內含子結構卻相對穩(wěn)定峡竣。在硬骨魚中靠抑，Venkatesh等比對了8個基因的外顯子-內含子結構，展示了內含子位置的變化發(fā)生在進化的特殊位點适掰。雖然還做了其它的研究颂碧，對于理解進化中內含子缺失和獲得的機制和選擇壓還有許多不確定性。
我們之前的分析表明在硬骨魚進化過程中孵化酶基因頻繁丟失它們的內含子类浪。孵化酶是一種在胚胎孵化時期降解卵膜的酶载城。這種酶屬于蝦紅素金屬蛋白酶家族像BMP1(骨形態(tài)發(fā)生蛋白1)和meprin(腎組織的金屬肽鏈內切酶)。在其它脊椎動物中也找到了孵化酶直系同源物费就。這些四足動物是由蝦紅素蛋白酶結構域和額外的C-末端結構域組成的多結構域蛋白诉瓦。在兩棲動物中爬行動物和鳥有一個或兩個C-末端CUB結構域，然而在哺乳動物中有一個未知的C-末端結構域力细。另一方面睬澡，硬骨魚的孵化酶僅由蛋白酶域組成。日本鰻鱺（一種低等的硬骨魚）和四足動物的編碼前導肽和蛋白酶域的基因其外顯子-內含子結構是保守的眠蚂。因此煞聪，可以推斷鰻鱺魚基因保持了祖先孵化酶基因的結構。在較高等硬骨魚中我們發(fā)現(xiàn)孵化酶基因會頻繁丟失它們的內含子河狐。如此頻繁的內含子丟失現(xiàn)象僅在孵化酶直系同源基因中發(fā)現(xiàn)，而在平行同源基因中未發(fā)現(xiàn)瑟捣。
真魚骨總目是脊椎動物26000種多樣化種系中的一種馋艺，并估計是由284-333百萬年前分支而來。最近用全線粒體DNA序列對硬骨魚的系統(tǒng)發(fā)生關系進行了廣泛研究迈套。分析結果可以闡明追溯到300MYA前的硬骨魚基因進化捐祠。我們比較多種硬骨魚孵化酶基因的外顯子-內含子結構，發(fā)現(xiàn)在硬骨魚發(fā)展史中孵化酶基因在特殊位點丟失它們的內含子桑李。
結果和討論
為確定真骨魚總目孵化酶基因結構變化的進化途徑踱蛀，我們克隆了27種基因窿给，其中包括15種新克隆的品種，這在材料與方法中有描述率拒。這些實驗種類都分布在真骨魚總目中崩泡，從低等到高等，分別如下：骨舌魚超目（Osteoglossomorpha）1類兩種猬膨，海鰱總目(Elopomorpha)4類的4種角撞，骨鰾下區(qū)魚(Otocephala)6類的8種，純真骨魚總目(Euteleostei)11類的13種勃痴。
- 孵化酶基因的多樣化
我們用所有實驗硬骨魚的孵化酶基因的蛋白酶域的核苷酸序構建最大似然樹（圖1）谒所。這棵樹分為兩個分枝：海鰱總目(Elopomorpha)基因分枝和骨鰾下區(qū)魚(Otocephala)及純真骨魚總目(Euteleostei)（鯡形亞部Clupeocephala）基因分枝。海鰱總目(Elopomorpha)基因通過短的分枝形成了單源分枝沛申。另一方面劣领，鯡形亞部（Clupeocephala）基因分枝可分成兩個分枝，為clade I和clade II铁材。每一分枝內各有兩個亞分枝尖淘，分別是骨鰾下區(qū)魚類(Otocephalan)和純真骨魚類(Euteleostean)亞分枝。這些結果表明在鯡形亞部（Clupeocephala）祖先的孵化酶基因中發(fā)生了復制事件（圖1）衫贬。通過Notung程序可由幾個家系中更多的復制事件（數(shù)據(jù)未顯示）重建祖先進化地位從而為復制事件提供依據(jù)德澈。我們目前對硬骨魚孵化酶基因的分析顯示低等硬骨魚有單一類型的基因。當鯡形亞部（Clupeocephala）從祖先中分枝出來后固惯，鯡形亞部（Clupeocephala）的祖先發(fā)生基因復制并且基因形成兩種類型梆造。
從實驗的鯡形亞部（Clupeocephala）中克隆出clade I的基因，clade I的基因的分枝模式反映出用全線粒體DNA序列預測的分子系統(tǒng)進化關系葬毫。從純真骨魚(Euteleostean)中克隆出clade II的基因镇辉。另一方面，在骨鰾下區(qū)魚類(Otocephalan)中贴捡，僅從clupeiform和gonorynchiform克隆出基因，沒有從otophysans( cypriniform, charaiform, gymnotiform 和siluriform)得到烂斋。事實可證clade II基因并沒有在斑馬魚（cypriniform）基因組序列中找到屹逛，目前只有三種clade I基因（2種ZHE1和1種ZHE2）在這個基因組中，clade II基因不存在汛骂。此外罕模，最近我們發(fā)現(xiàn)只有clade I基因（ZHE1）表達出的ZHE1酶參與了斑馬魚胚胎的孵化。這些結果表明clade II基因特異地在otophysan家系中消失了帘瞭。
在純真骨魚(Euteleostean)孵化酶的蛋白水平研究中淑掌，用青鳉和一種產于淡水的鳉科小魚得到了兩種類型的孵化酶。根據(jù)它們如何降解卵膜分別取名HCE和LCE蝶念。從其它的純真骨魚(Euteleostean)中克隆出HCE和LCE的直系同源基因抛腕，在目前的系統(tǒng)進化樹中它們分別位于clade I和clade II（圖1）芋绸。
- 硬骨魚類孵化酶基因中內含子丟失的進化
如圖1所畫的系統(tǒng)樹，孵化酶基因的外顯子－內含子結構顯示了進化過程中特征內含子丟失模式担敌。在這個部分將描述（1）骨舌魚超目和海鰱總目孵化酶基因摔敛，（2）鯡下區(qū)魚clade I基因和（3）鯡下區(qū)魚cladeII基因的外顯子-內含子結構以及（4）討論它們的進化。
圖1 孵化酶基因的外顯子－內含子結構和系統(tǒng)發(fā)生樹柄错。這最大似然樹是用osteoglossiform基因（AwHE）作為外圍從硬骨魚孵化酶基因的成熟酶相應的核苷酸序列構建的舷夺。節(jié)點的數(shù)字代表靴值支持值，值低于50%的舍棄售貌「基因名字的右邊顯示了外顯子-內含子結構。與假定的祖先孵化酶基因對應的內含子數(shù)目顯示在頂部颂跨「疑欤框里的數(shù)字代表內含子相位，黒框表示保守的內含子恒削，白色表示丟失的內含子池颈，灰色表示插入內含子或者是內含子與祖先基因有不同的內含子相位。
- 骨舌魚超目（Osteoglossomorpha）和海鰱總目(Elopomorpha)基因
除了少數(shù)例外（EHE7和PeHE1）钓丰，骨舌魚超目（Osteoglossomorpha）和海鰱總目(Elopomorpha)基因的外顯子-內含子結構都是保守的躯砰。基因是由8個內含子插入在9個外顯子中組成的携丁。外顯子1到外顯子4中間部分編碼前導肽區(qū)琢歇，余下的外顯子4到外顯子8編碼全部蛋白酶域，外顯子9再加上整個3'末端僅編碼終止密碼子的兩個核苷酸(EHE4)或者是蛋白酶域C-末端的4個添加的氨基酸（EHE7）梦鉴。由于第九個外顯子的序列相似性較低李茫，經(jīng)常很難直接確定它在基因組DNA中的位置。然而肥橙，鑒于5'拼接位點的共有序列“GT”的存在我們預測到第8個內含子的存在魄宏。這個“GT”在骨舌魚超目（Osteoglossomorpha）和海鰱總目(Elopomorpha)中找到，除了BtHE基因的外顯子8是由編碼序列和終止密碼子組成存筏。從這些結果中我們得出這些基因中第9個外顯子顯然存在宠互。這些外顯子-內含子結構和四足動物基因是一樣，包括內含子相位（內含子位置在密碼子間或內部）椭坚，這表明祖先硬骨魚孵化酶基因有一個9-外顯子-8-內含子結構予跌。
- 鯡形亞部（Clupeocephala）clade I基因
鯡形亞部（Clupeocephala）的復制基因（clade I 和clade II基因）中，clade I基因有著與祖先基因不同的多變的外顯子-內含子結構藕溅。圖1表明骨鰾下區(qū)魚(Otocephalan) clade I基因在進化中相繼丟失內含子匕得。在clupeiforms和Gonorynchiforms中继榆，雖然它們的外顯子-內含子結構與祖先基因很相似巾表，但通常有一個內含子（祖先基因的第二個內含子）通常會丟失汁掠，它們擁有一個8-外顯子-7-內含子的結構（除兩個例外AcHE2 和MfHE2）。在cypriniforms中集币，clade I基因是5-外顯子-4-內含子結構：這個結構是由于另外3個內含子（第6考阱，7，8內含子）的丟失造成的鞠苟，在外顯子區(qū)域沒有核苷酸的缺失和插入乞榨。Characiphysans (characiforms, gymnotiforms and siluriforms ) clade I基因又多丟失一個內含子（第1個內含子），結果得到一個4-外顯子-3-內含子結構当娱。
與骨鰾下區(qū)魚(Otocephalan)基因相反吃既，純真骨魚(Euteleostean) clade I基因除了salmoniforms 和esociforms外其它沒有內含子，結果導致無內含子的結構跨细。Salmoniforms 和esociforms有兩個clade I基因鹦倚。 這些（MsHCE1, RbHCE1 和PkHCE1）中的每一個都是由1個內含子插在兩個外顯子中組成的，結果形成了一個2-外顯子-1-內含子結構冀惭，而其它的（MsHCE2, RbHCE2 和PkHCE2）顯示的是內含子缺失的結構震叙。上述基因的內含子插入位點與其它孵化酶基因不一致，這表明在純真骨魚(Euteleost)祖先丟失全部內含子后散休，salmoniforms 和esociforms的共同祖先發(fā)生了復制事件媒楼，一個內含子新插入到這兩種clade I基因中的一種內。
- 鯡形亞部（Clupeocephala）clade II基因
與clade I基因不同戚丸，clade II基因的外顯子-內含子結構相對穩(wěn)定划址。骨鰾下區(qū)魚(Otocephalan) clade II基因由9個外顯子和8個內含子組成(和祖先基因相同)，鳳尾魚（anchovy）基因（AcHE4和AcHE5）例外昏滴，它們的內含子缺失/獲得被證實特異地發(fā)生在鳳尾魚家系中猴鲫。大部分純真骨魚(Euteleostean)clade II基因的外顯子-內含子結構與祖先基因相似，盡管觀察到第8個內含子有缺失谣殊。然而Salmoniform 和esociform基因與其它基因很不同拂共，顯示了內含子缺失的結構。salmoniforms 和esociforms的共同祖先可能也發(fā)生內含子丟失的現(xiàn)象姻几。
- 外顯子-內含子結構變化的進化途徑
孵化酶基因外顯子-內含子結構變化的進化途徑由用全線粒體基因序列預測的硬骨魚分子系統(tǒng)發(fā)生關系為基礎推斷出來宜狐。骨舌魚超目（Osteoglossomorpha）和海鰱總目(Elopomorpha)有單一類型的孵化酶基因∩甙疲基因復制發(fā)生在鯡形亞部（Clupeocephala）從祖先中分支出來后抚恒，而后鯡形亞部（Clupeocephala）擁有兩種基因，clade I和clade II基因络拌。骨鰾總目（otophysan）的祖先丟失了clade II基因俭驮。在骨鰾下區(qū)魚(Otocephalan)進化過程中，clade I基因逐步丟失內含子，如骨鰾下區(qū)魚(Otocephalan)低等家系丟失1個內含子混萝，骨鰾總目（otophysan）的祖先祖先再丟失3個內含子遗遵，characiphysans祖先又丟失一個額外的內含子。在純真骨魚(Euteleost)進化過程中逸嘀，所有的內含子都從clade I基因中丟失车要，而在salmoniforms 和esociforms共同祖先中有一個內含子新插入到兩種clade I基因的一種中。與clade I基因相反崭倘，clade II基因不用經(jīng)歷頻繁的結構的變化翼岁；然而實驗可知在純真骨魚(Euteleost)進化過程中有一個內含子（8th內含子）丟失，salmoniforms和esociforms的共同祖先丟失了所有內含子司光。
圖2硬骨魚（teleostean）孵化酶基因進化途徑琅坡。鯡形亞部（Clupeocephalan）祖先的孵化酶基因發(fā)生復制事件（黑框），鯡形亞部（Clupeocephalan）擁有clade I基因（紅線）和clade II基因（藍線）残家。骨鰾總目（otophysan）的祖先丟失2型基因袱衷。家系中內含子丟失/插入事件由紅三角（clade I基因）和藍三角（clade II基因）表示丹禀。外顯子-內含子結構在右邊用相同顏色表示斋扰。硬骨魚（teleostean）進化分支圖是基于整個線粒體基因序列加一些修飾預測出的分子系統(tǒng)發(fā)生關系構建的陵刹。
內含子為什么會丟失?
為什么在真骨魚總目（Teleostei）孵化酶基因進化過程中會頻繁發(fā)生內含子丟失？根據(jù)以下信息我們猜測內含子丟失是為適應有效產生孵化酶碾盐。推測花費1分鐘可轉錄1-1.5kbp序列晃跺，再用3分鐘移除前mRNA序列的內含子。根據(jù)這些信息毫玖，我們目前推測了孵化酶基因具有內含子和內含子缺失的轉錄時間掀虎。根據(jù)孵化酶基因外顯子區(qū)域的平均長度（1kbp）以及內含子的平均大小（約250bp）付枫，有8個內含子的基因大約是3kbp而內含子缺失的基因大約是1kbp烹玉。因此，含8個內含子的基因需要2-3分鐘時間完成轉錄阐滩，另外至少需3分鐘剪接內含子二打。另一方面，轉錄內含子缺失的基因花費少于1分鐘掂榔。實際上继效，缺失內含子的基因能迅速表達是眾所周知的。
我們首先對青鳉胚胎孵化酶基因是否比持家基因更有效地表達進行實驗装获。如圖3A所示瑞信，MHCE基因的表達水平比持家基因β-肌動蛋白和GAPDH高三倍，而MLCE基因的表達水平與持家基因相似穴豫。它們的表達水平并沒有我們想象的高凡简。我們進一步比較了稱為孵化腺細胞（HGC）的細胞內的表達水平，這種細胞可以表達孵化酶基因。HGC分布在青鳉原始孵化胚胎的咽腔內壁或者是遮目魚秤涩、泥鰍翁逞、鯰魚、虹鱒魚溉仑、鱈魚的表面。孵化酶基因并不像持家基因状植，它在特定的細胞內表達浊竟，表明細胞內孵化酶基因表達水平遠高于持家基因。直到立即孵化前津畸，由酶原粒積聚成孵化酶振定。這些結果表明HGC為合成孵化酶提供大量資源。
接下來我們檢測了幾種魚中clade I和clade II基因的表達水平肉拓。圖3A表明青鳉胚胎中MHCE基因（clade I）的表達比MLCE基因（clade II）高6倍后频。此外，Northern分析7種魚暖途，顯示clade I基因表達水平比clade II基因表達水平更高的趨勢卑惜。這種有差別的表達反映了降解卵膜所需孵化酶的相對量。在青鳉孵化時驻售，MHCE和MLCE一同降解卵膜：MHCE利用蛋白水解作用使卵膜膨脹露久，而MLCE把膨脹的卵膜完全降解。體外實驗顯示需要大量的MHCE來使卵膜膨脹欺栗，而僅需一小部分的MLCE足夠去降解卵膜毫痕。在遮目魚中也發(fā)現(xiàn)了這種關系。這些結果表明clade I基因需表達大量的蛋白質迟几。一個基因少量的內含子對它的高表達有利消请，那么clade I基因在進化過程中可能丟失它們的內含子以致在HGC中有高表達。
圖3孵化酶基因的表達水平和孵化腺細胞的分布类腮。（A）用Northern雜交比較了青鳉胚胎孵化酶基因（MHCE和MLCE）和持家基因（β-肌動蛋白和GAPDH）的相對表達水平臊泰。mRNA的相對表達水平用光密度法測定，并設定β-肌動蛋白的相對強度為1蚜枢。（B）用Northern雜交分析孵化酶基因的表達因宇。基因名稱在頂部一行顯示祟偷，clade I基因用下劃線標注察滑。三角形標注了28S和18S rRNA的位置。（C）青鳉胚胎較低的下顎部分用甲苯胺染成藍色修肠。HGC（箭頭）處有許多酶原顆粒贺辰。PC，咽腔。比例尺饲化，10微米莽鸭。（D-H）用全胚胎原位雜交定位遮目魚（D），泥鰍（E）吃靠，鯰魚（F）硫眨，虹鱒魚（G）和鱈魚（H）胚胎早期孵化中的HGC的分布。D和H是背部相巢块，F(xiàn)和G是腹部相礁阁，都是頭部區(qū)域，E是側面相族奢。比例尺姥闭，200微米。
內含子是怎么丟失的呢越走？
目前針對內含子丟失的機制有兩種主要的模型：
- 在基因組水平上刪除棚品；
- 成熟mRNA或部分剪接的前mRNA反轉錄為cDNA和一個基因在基因組水平上的復制之間發(fā)生了同源重組。
第一種模型下的刪除并不會經(jīng)常導致一個內含子區(qū)域的精確去除廊敌。實驗中的孵化酶基因铜跑，在其成熟的酶編碼區(qū)域內缺失的插入位點上沒有發(fā)現(xiàn)額外的核苷酸插入或刪除。也許用牽涉到同源重組的第二種模型更好解釋如此精確的內含子刪除現(xiàn)象骡澈。然而疼进，這種內含子刪除的進化形成一定會在種系的基因表達上受限。孵化酶基因僅在胚胎發(fā)育時期表達秧廉，而且從不在生殖細胞中表達伞广。
很難解釋發(fā)生在孵化酶基因的6個內含子丟失事件僅僅是同源重組的結果，因為很難想象孵化酶基因的異常表達會如此頻繁地發(fā)生在微生殖細胞內疼电。有一些其它的內含子丟失的例子可說明這不是通過逆轉錄酶調節(jié)的（i.e 基因的內含子缺失表達在非生殖腺嚼锄，體細胞，發(fā)生在無核酸刪除或插入處）蔽豺。一個關于內含子準確移除的“未知的機制”肯定存在区丑。雖然在特殊環(huán)境下硬骨魚類孵化酶基因內含子丟失的進化可能是一個稀有的情況，但未來對這個現(xiàn)象的研究應該會顯示和提高對內含子丟失新機制的理解修陡。
結論
硬骨魚祖先孵化酶基因被認為是一種單型基因沧侥。在鯡形亞部（Clupeocephalan）從祖先中分支出來后，孵化酶基因發(fā)生了復制魄鸦。所以宴杀，鯡形亞部（Clupeocephalan）擁有兩種孵化酶基因，clade I和clade II基因拾因。與clade II基因(0-1內含子缺失旺罢，一種特殊的顯示為8內含子缺失)相反旷余，clade I基因(1-8內含子缺失)頻繁丟失它們的內含子。當比較表達水平時扁达，內含子丟失的基因比內含子保守的基因有更高地表達正卧，暗示內含子丟失的進化可能與其表達水平有關系。
方法
- 魚
胚胎和成魚樣品從以下組織中獲得：漁業(yè)研究機構宮站跪解，資源增值國家中心的日本牙鲆稚魚炉旷；中國科學院的細胞和有機體生物研究所的遮目魚；北海道大學水產科學研究生院的泥鰍叉讥；千葉縣漁業(yè)研究中心淡水站的鯰魚窘行；水產養(yǎng)殖國家研究所的三文魚；東京鱒魚孵化場的虹鱒魚节吮；富三縣水產研究所漁業(yè)資源組的鱈魚；東京大學氣象與海洋研究所的各種鰻魚判耕；從商人那里買來的龍魚和其它的魚透绩。
- 孵化酶cDNA的克隆以及它們的基因組序列
先前報道的硬骨魚孵化酶基因是多拷貝基因。為了克隆所有種類的孵化酶基因壁熄，我們從克隆基因保守的區(qū)域設計了四套PCR引物帚豪。用這些引物通過RT-PCR和RACE PCR從6種孵化前胚胎的RNA中分離到孵化酶cDNA全長序列。在基因組基因分離后草丧，我們通過對比cDNA序列檢測了基因組DNA的外顯子-內含子界限狸臣。
有些情況下我們不能獲得胚胎，就通過PCR直接從成魚的基因組DNA克隆出孵化酶基因昌执。在密切相關種相似的基礎上我們證實了克隆基因外顯子-內含子的界限烛亦。從基因組DNA直接克隆的方法如下。五種引物懂拾，四種正向引物（F1到4）和一種反向引物（R1）煤禽，是從孵化酶cDNA保守序列中設計出來的。從這些片段中我們又構建了正向和反向的基因特定引物（GSPs）岖赋。接下來檬果，分別用正向GSP和R2引物（從克隆的cDNA 3'末端保守區(qū)設計出）或者是用反向GSP和F5引物（從克隆的cDNA 5'末端保守區(qū)設計出）來延伸3'和5'部分。F1-5和R1-2引物的序列展示在下面唐断，它們的位置顯示在附加文件2选脊。
F1: 5′-RVMVRMTGYYTiTGGARSAARDVYBC-3′
F2: 5′-ARACMTGCATTCGYTTYRTBYCHHG-3′
F3: 5′-YRYYCAGCAYGAGMYBMDYCAYGCiCTSGG-3′
F4: 5′-HTTCYAiCAYGARCAHDYHAGRAGCGAYCG-3′
F5: 5′-TBCWRVYBCTGBTVBTBRGMHTYTCiYWRGC-3′
R1: 5′-TTCCATARTGCATSABVGARSHRTAGTCRTA-3′
R2: 5′-RCAKYYRTABAKHiKVTTGATYCYSARRATRTC-3′
像前面所述，大部分的孵化酶基因被預測為多拷貝基因脸甘，用短的基因區(qū)域形成串恳啥。因此，用GSP擴增孵化酶基因間的短基因區(qū)域丹诀。在某些情況下角寸，基因的5'或3'區(qū)域通過ACP-PCR方法來延伸菩混。通過結合上面的PCR方法，可克隆出包括5'-上游和3'-下游區(qū)域的基因全長扁藕【谙浚克隆出的序列包括孵化酶基因和與它們平行進化的同源基因。像之前報道的亿柑，孵化酶基因在孵化前胚胎中特異表達邢疙，而它們的平行進化同源基因則主要在成體內部器官表達。我們通過系統(tǒng)發(fā)生分析和全胚胎原位雜交區(qū)分孵化酶基因與它們的平行進化同源基因望薄∨庇危克隆出的孵化酶基因的名稱列在附加文件1中。
- 系統(tǒng)進化分析
成熟酶對應的核苷酸序列的密碼子定位是用Clustal X 程序和密碼子2.0程序實現(xiàn)的痕支。數(shù)據(jù)被劃分為第一颁虐、二、三密碼子位點卧须。GTR+I+Γ被選為最佳擬合模型另绩。用RAxML 7.2.6 實現(xiàn)最大似然分析。我們重建了進化樹花嘶，同時以1000次重復進行靴值分析獲得最佳拓撲值笋籽。
我們使用Notung 2.6的程序匹配孵化酶基因樹和硬骨魚類進化樹。Notung可標注基因的復制和丟失事件椭员，在物種進化樹分支上用簡約法（parsimony method）重定位祖先的進化地位车海。使用全線粒體DNA序列預測其分子系統(tǒng)進化樹，從而獲得種族進化樹的拓撲結構隘击。
- 全胚胎原位雜交
全胚胎原位雜交根據(jù)前面所描述的方法進行侍芝。DIG標記的RNA探針是從遮目魚、泥鰍埋同、鯰魚竭贩、鱈魚和虹鱒魚的孵化酶基因中合成的，在孵化前胚胎中雜交莺禁。
- Northern印跡分析
為了比較青鳉孵化酶基因（MHCE 和 MLCE）和持家基因(β-肌動蛋白和GAPDH)的表達水平留量，從胚胎中提取出總RNA。4微克的RNA在1%的甲醛瓊脂糖凝膠上電泳哟冬，然后轉移到尼龍膜上楼熄。孵化酶基因和持家基因的cDNA用于合成DIG標記的PCR探針。每個探針的大小調整到816個堿基浩峡，標記效率用斑點印跡法核對可岂。雜交則用前面所述的流程進行。用ImageQuant軟件分析影像從而對基因表達水平進行半定量評估翰灾。
