免疫共沉淀
免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation鹅经，CoIP）抗體和抗原之間的專(zhuān)一性為基礎(chǔ)，用于研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法怎诫。是確定兩種蛋白質(zhì)在完整細(xì)胞內(nèi)生理性相互作用的有效方法瘾晃。
免疫共沉淀的設(shè)計(jì)理念是，假設(shè)一種已知蛋白是某個(gè)大的蛋白復(fù)合物的組成成員刽虹，那么利用這種蛋白的特異性抗體酗捌，就可能將整個(gè)蛋白復(fù)合物從溶液中“拉”下來(lái)（常說(shuō)的“pull-down”），進(jìn)而可以用于鑒定這個(gè)蛋白復(fù)合物中的其他未知成員涌哲。免疫共沉淀的特點(diǎn)可以概括為兩點(diǎn)胖缤，第一是天然狀態(tài)，第二是蛋白復(fù)合物阀圾。
實(shí)驗(yàn)步驟
1.細(xì)胞轉(zhuǎn)染后?24～48 h收蛋白哪廓，將細(xì)胞培養(yǎng)皿放于冰上，用預(yù)冷PBS洗三次初烘。加入適量細(xì)胞裂解緩沖液（含蛋白酶抑制劑）涡真，冰上裂解10 min。用細(xì)胞刮輕輕刮下細(xì)胞肾筐，用移液槍將細(xì)胞裂解液轉(zhuǎn)移至干凈EP管中哆料，冰上輕輕吹打，避免氣泡產(chǎn)生吗铐。然后于4 ℃離心機(jī)东亦，最大轉(zhuǎn)速離心13000rpm，離心10 min?后取上清唬渗。
2.取少量裂解液轉(zhuǎn)移至干凈EP管中典阵，以備?Western blot?分析。剩余裂解液加100ul相應(yīng)的帶有X抗體瓊脂糖珠加入到細(xì)胞裂解液镊逝，4 ℃緩慢搖晃孵育過(guò)夜壮啊。
3.免疫沉淀反應(yīng)后，在?4 ℃以?3 000 rpm?速度離心5min撑蒜，將瓊脂糖珠離心至管底歹啼；將上清小心吸去，管底的瓊脂糖珠用預(yù)冷PBS洗三次座菠。然后加入500ul裂解緩沖液染突，最后加入125μl?的5× SDS?上樣緩沖液，沸水煮?5?分鐘,以游離抗原辈灼、抗體、珠子也榄。4 ℃離心機(jī)巡莹，最大轉(zhuǎn)速離心?10 min司志，取上清。
4.?取上清進(jìn)行蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)降宅，確定結(jié)合蛋白骂远。
注意事項(xiàng)
1.細(xì)胞裂解采用溫和的裂解條件，不能破壞細(xì)胞內(nèi)存在的所有蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用腰根，多采用非離子變性劑（NP40 或Triton X-100)激才。每種細(xì)胞的裂解條件是不一樣的，通過(guò)經(jīng)驗(yàn)確定额嘿。不能用高濃度的變性劑（0.2％SDS)瘸恼，細(xì)胞裂解液中要加各種酶抑制劑。
2.免疫共沉淀是建立在蛋白復(fù)合物成員間彼此緊密結(jié)合的基礎(chǔ)上册养，意味著松散結(jié)合的蛋白組分很可能檢測(cè)不到东帅。
3.由于蛋白質(zhì)形成復(fù)合物以后，某些表位就會(huì)被掩蓋球拦，因此可能導(dǎo)致使用某一種pull-down抗體靠闭，無(wú)論怎么增加抗體濃度，也極少能將不到一半的目標(biāo)蛋白復(fù)合物沉淀出來(lái)坎炼，如有必要最好使用多種不同抗體分別進(jìn)行CoIP愧膀。
4.得到了復(fù)合物，實(shí)驗(yàn)就大功告成啦谣光？哪有這么簡(jiǎn)單檩淋。?CoIP鑒定得到的蛋白間相互作用可能是直接作用也可能是間接作用，進(jìn)一步區(qū)分還需要進(jìn)行GST-Pull down等實(shí)驗(yàn)檢測(cè)抢肛。
5.為了保證CoIP實(shí)驗(yàn)的可靠性和嚴(yán)謹(jǐn)性狼钮，需要使用復(fù)合物的不同成員分別獨(dú)立進(jìn)行CoIP實(shí)驗(yàn)，并且結(jié)果應(yīng)該能夠彼此驗(yàn)證捡絮，因?yàn)樵瓌t上使用復(fù)合物的任一成員進(jìn)行CoIP都會(huì)得到其他所有成員熬芜。
7個(gè)關(guān)鍵控制點(diǎn)
1.有效裂解細(xì)胞。
2.恰當(dāng)選擇處理樣本的方式：超聲或酶處理福稳。
3.選用適當(dāng)適量抗體涎拉。
4.恰當(dāng)設(shè)置對(duì)照。
5.不要過(guò)分交聯(lián)DNA-蛋白質(zhì)的圆。
6.交聯(lián)所用的甲醛終濃度約為1%鼓拧，交聯(lián)時(shí)問(wèn)需要預(yù)實(shí)驗(yàn)來(lái)確定。
7.注意PCR策略具體來(lái)說(shuō)：恰當(dāng)設(shè)置chip實(shí)驗(yàn)對(duì)照越妈，設(shè)置適當(dāng)?shù)年?yáng)性和陰性對(duì)照是進(jìn)行ChIP結(jié)果分析的重要步驟和Trouble shooting的依據(jù)季俩，因?yàn)榉翘禺愋缘拿庖叱恋黼y以避免。
內(nèi)容再好梅掠，終究只是參考資料酌住，付諸實(shí)踐店归、提高學(xué)習(xí)深度才是關(guān)鍵！fighting~
