作者：路子
審稿：童蒙
編輯：angelica

細(xì)胞位置信息對(duì)于干細(xì)胞分化，組織發(fā)育以及腫瘤組織微環(huán)境起著重大的作用仿滔，那么空間轉(zhuǎn)錄組在這些研究領(lǐng)域中是如何設(shè)計(jì)如何解決科學(xué)問(wèn)題的呢？跟著小編一探究竟吧赃承。

之前跟大家一起瀏覽了10X Genomics Visium 空間轉(zhuǎn)錄組的分析流程（不可錯(cuò)過(guò)的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組研究新維度：空間轉(zhuǎn)錄組）
踱讨，這次跟大家分享一下空間轉(zhuǎn)錄組的應(yīng)用領(lǐng)域以及研究的思路。

根據(jù)10X Genomics 官網(wǎng)上公布的利用ST（Spatial Transcriptomics）技術(shù)進(jìn)行研究的文獻(xiàn)舰绘，可以看到該技術(shù)涵蓋了腫瘤、發(fā)育葱椭、疾病等領(lǐng)域捂寿，涉及到腫瘤、淋巴孵运、大腦秦陋、心臟等各種組織。同時(shí)空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)除了可以應(yīng)用在常見(jiàn)的哺乳動(dòng)物治笨，也可以應(yīng)用在植物學(xué)的研究上驳概。

1. 應(yīng)用領(lǐng)域—腫瘤

我們以2020年1月份發(fā)表在Nature Biotechnology 上，對(duì)PDAC（胰腺導(dǎo)管腺癌）的研究為例旷赖，探討下空間轉(zhuǎn)錄組在腫瘤生物學(xué)方面的研究顺又。

該研究主要整合了原ST技術(shù)和單細(xì)胞RNA技術(shù)，彌補(bǔ)了原ST分辨率較低等孵、單細(xì)胞RNA缺乏空間信息的缺點(diǎn)稚照，兩者互相補(bǔ)充，實(shí)現(xiàn)了單細(xì)胞水平加空間的全面無(wú)偏的癌癥組織分析流济。

1.1研究問(wèn)題

1.探究PDAC組織的細(xì)胞類(lèi)型锐锣，以及與空間相關(guān)的細(xì)胞亞型
2.探究不同腫瘤樣本微環(huán)境特點(diǎn)

1.2研究實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

如上圖所示，作者分兩條線(xiàn)進(jìn)行設(shè)計(jì)分析绳瘟，取兩名PDAC患者的2例新鮮PDAC-A和B腫瘤組織雕憔，同時(shí)進(jìn)行scRNA-seq和ST建庫(kù)測(cè)序分析。

• scRNA-seq 分析流程：制備細(xì)胞懸浮液—Droplet-based 文庫(kù)制備—測(cè)序—信息分析（鑒定細(xì)胞群體類(lèi)型）
• ST-seq分析流程：制備組織切片—建庫(kù)—測(cè)序—信息分析（組織空間成像點(diǎn)表達(dá)情況)
• 最后通過(guò)引入多模式相交分析（Multimodal intersection analysis糖声，MIA）整合scRNA和ST數(shù)據(jù)集進(jìn)行空間區(qū)域的細(xì)胞亞群分類(lèi)斤彼。

1.3分析思路與結(jié)果總結(jié)

scRNA-seq 細(xì)胞分類(lèi)：利用CNV和細(xì)胞分類(lèi)分析以及熒光標(biāo)記實(shí)驗(yàn)證實(shí)了PDAC-A包含兩種癌癥細(xì)胞群cluster1(TM4SF1)和cluster2(S100A4)，PDAC-B包含一種癌癥細(xì)胞群cluster1（TM4SF1）蘸泻。

ST-seq細(xì)胞分群：依據(jù)病理學(xué)進(jìn)行組織分區(qū)琉苇，計(jì)算Spots表達(dá)水平進(jìn)行PCA分類(lèi)，發(fā)現(xiàn)cluster與組織分類(lèi)是一致的悦施。

MIA算法整合分析：
1.發(fā)現(xiàn)在組織空間受限區(qū)域中含有特定的細(xì)胞類(lèi)型和特定細(xì)胞亞群的富集并扇。例如PDAC-A的成纖維細(xì)胞特異性基因與ST分析結(jié)果中的特定區(qū)域的一組基因具有很強(qiáng)的一致性；除此之外抡诞，還發(fā)現(xiàn)了導(dǎo)管上皮區(qū)域富含導(dǎo)管細(xì)胞穷蛹，胰腺組織區(qū)域富含腺泡細(xì)胞和分泌細(xì)胞土陪。
2.依據(jù)MIA結(jié)果繪制了不同腫瘤樣本微環(huán)境的特點(diǎn)、免疫環(huán)境狀態(tài)肴熏、應(yīng)激水平以及細(xì)胞之間相互作用的模式鬼雀，有助于對(duì)患者預(yù)后進(jìn)行預(yù)判。

熒光實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證：利用免疫熒光標(biāo)記實(shí)驗(yàn)進(jìn)行結(jié)果驗(yàn)證蛙吏。

1.4 總結(jié)

該文章的一大亮點(diǎn)是引入了MIA算法進(jìn)行空間和單細(xì)胞的整合源哩，目前10X Genomics visium 系統(tǒng)大大提升了空間分辨率，一個(gè)Spot大概包含1-10個(gè)單細(xì)胞（主要受研究的組織細(xì)胞直徑的影響）鸦做，幾乎接近單細(xì)胞水平励烦。

2.應(yīng)用領(lǐng)域—組織發(fā)育

接下來(lái)我們一起看一下，發(fā)表在Cell上一篇關(guān)于人類(lèi)心臟研究的文章馁龟，充分發(fā)揮了空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)崩侠，全方位展示了單細(xì)胞空間分辨率下的全器官模式漆魔。

該研究利用空間轉(zhuǎn)錄組（ST）坷檩、單細(xì)胞（scRNA）和原位測(cè)序（in situ sequencing，ISS）技術(shù)進(jìn)行聯(lián)合分析改抡，最終獲得了人類(lèi)心臟發(fā)育的時(shí)間矢炼、空間的基因表達(dá)模式，并深入探討了不同類(lèi)型細(xì)胞的功能阿纤。同時(shí)創(chuàng)建了人類(lèi)胚胎心臟的公共網(wǎng)絡(luò)資源句灌，共享研究數(shù)據(jù)和成果。

2.1研究設(shè)計(jì)

研究設(shè)計(jì)如上圖所示欠拾，取來(lái)自3個(gè)人的孕4.5-5周胰锌、6.5周和9周的心臟組織，采用ST藐窄、scRNA 和原位測(cè)序三種技術(shù)手段资昧，從時(shí)間、空間兩個(gè)維度展示了人類(lèi)心臟發(fā)育表達(dá)的模式荆忍。

• ST：組織切片—建庫(kù)—測(cè)序—信息分析（降維聚類(lèi)格带，細(xì)胞分類(lèi)）
• scRNA-seq：細(xì)胞懸液—建庫(kù)—測(cè)序—信息分析（降維聚類(lèi)，細(xì)胞分類(lèi)）
• ISS：獲得基因表達(dá)的位置信息
• 最后刹枉，結(jié)合三種技術(shù)進(jìn)行人類(lèi)胚胎心臟3D建模叽唱，構(gòu)建了全方位組織基因表達(dá)圖譜。

2.2分析思路與結(jié)果總結(jié)

STseq分析：對(duì)不同孕期的胚胎心臟切片進(jìn)行空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)分析微宝，經(jīng)過(guò)降維聚類(lèi)棺亭，差異表達(dá)等分析，最終獲得了10個(gè)cluster細(xì)胞類(lèi)型蟋软，并標(biāo)注了10個(gè)cluster特異性表達(dá)的基因镶摘。

scRNAseq分析：對(duì)孕6.5周胚胎心臟分割兩部分進(jìn)行scRNA建庫(kù)測(cè)序分析专甩，經(jīng)過(guò)降維聚類(lèi)，獲得15個(gè)cluster細(xì)胞類(lèi)型钉稍，鑒定到的細(xì)胞類(lèi)型與先前報(bào)道一致涤躲。

ISS分析：利用ISS的亞細(xì)胞空間分辨率的特性，運(yùn)用pciSeq方法創(chuàng)建了一個(gè)綜合概率贡未，確定scRNA定義的細(xì)胞類(lèi)型的空間細(xì)胞圖譜种樱，從而實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞分辨率的基因表達(dá)時(shí)空分析。

作者把運(yùn)用這三種技術(shù)整合的人類(lèi)胚胎心臟發(fā)育的時(shí)空基因表達(dá)圖譜數(shù)據(jù)提交到一個(gè)公共網(wǎng)站上俊卤，以共享數(shù)據(jù)成果嫩挤。https://hdca-sweden.scilifelab.se/a-study-on-human-heart-development/

2.3總結(jié)

ISS技術(shù)是2013年發(fā)表在Nature Methods 上的一篇文章，主要講述了這種擴(kuò)增測(cè)序方法消恍。滾環(huán)擴(kuò)增：這種方法依賴(lài)一種鎖式（padlock）探針岂昭，它與目標(biāo)序列的任一側(cè)雜交，以形成環(huán)狀模板狠怨，進(jìn)行復(fù)制约啊。由于產(chǎn)物是拴在模板上的，這提供了可靠定位佣赖，并可通過(guò)連續(xù)的寡核苷酸探針摻入恰矩，實(shí)現(xiàn)原位測(cè)序。這項(xiàng)技術(shù)一般用于序列（RNA憎蛤，基因）組織細(xì)胞定位驗(yàn)證分析外傅。

3. 應(yīng)用領(lǐng)域—疾病

關(guān)于ST技術(shù)在疾病研究領(lǐng)域的介紹，我們以2019年12月發(fā)表在Scientific Reports 上的一篇關(guān)于關(guān)節(jié)炎的研究為例俩檬，一起探討下這項(xiàng)技術(shù)的應(yīng)用思路萎胰。

該研究主要利用ST空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)，探索了類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）和脊柱關(guān)節(jié)炎（SpA）的炎癥信號(hào)通路棚辽。揭示了在RA中技竟，適應(yīng)性免疫反應(yīng)與T-B細(xì)胞相互作用，而在SpA中晚胡，適應(yīng)性免疫反應(yīng)與組織修復(fù)功能相關(guān)灵奖。

3.1研究設(shè)計(jì)

研究設(shè)計(jì)如上圖所示，分別取RA和SpA各3名患者估盘，取其髖部或者膝蓋處的滑膜組織進(jìn)行ST建庫(kù)測(cè)序分析瓷患，揭示了慢性炎癥性疾病的細(xì)胞機(jī)制和在組織中的功能的多樣性。例如在RA中遣妥，適應(yīng)性免疫反應(yīng)與T-B細(xì)胞相互作用擅编，而在SpA中，適應(yīng)性免疫反應(yīng)與組織修復(fù)功能相關(guān)。

3.2分析思路和結(jié)果總結(jié)

ST分析：取每個(gè)患者病患處3個(gè)部位滑膜組織爱态，每個(gè)患者3個(gè)部位的數(shù)據(jù)合并在一起作為一個(gè)bulk對(duì)單個(gè)組織切片進(jìn)行糾正對(duì)比谭贪。由bulk和單個(gè)組織差異表達(dá)分析來(lái)看，RA與T細(xì)胞锦担、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor俭识，TNF）關(guān)聯(lián)更強(qiáng)，而SpA組織的特征更多在于軟骨損傷和修復(fù)系統(tǒng)的過(guò)程洞渔。

功能分析：利用Ingenuity Pathway Analysis (IPA) and Metascape (http://metascape.org)軟件對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行功能和分子網(wǎng)絡(luò)通路分析套媚，發(fā)現(xiàn)RA與適應(yīng)性免疫應(yīng)答相關(guān)，SpA與細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)磁椒、與軟骨損傷修復(fù)過(guò)程相關(guān)堤瘤。

細(xì)胞類(lèi)型鑒定：利用Xcell軟件進(jìn)行細(xì)胞類(lèi)型的鑒定，展現(xiàn)了空間組織區(qū)域細(xì)胞的類(lèi)型浆熔。

4. 應(yīng)用領(lǐng)域—植物學(xué)

前面介紹了人類(lèi)腫瘤本辐、發(fā)育和疾病相關(guān)的研究，那么ST技術(shù)能否應(yīng)用于植物學(xué)上医增，為農(nóng)林研究貢獻(xiàn)一種新技術(shù)慎皱、新方案呢？答案是肯定的调窍。下面這篇就是2017年發(fā)表在Nature Plant 雜志上的一篇關(guān)于植物學(xué)的研究宝冕。

該研究利用空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)首先在被子植物和裸子植物中模擬了生成空間轉(zhuǎn)錄組圖譜的可行性张遭，并且在擬南芥中識(shí)別了141個(gè)表達(dá)差異基因和花序組織區(qū)域的功能通路上的189個(gè)差異基因邓萨。空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)與功能學(xué)結(jié)合研究菊卷，將為植物發(fā)育缔恳、進(jìn)化等研究帶來(lái)新的思路和新的方法。

4.1研究設(shè)計(jì)

研究設(shè)計(jì)如上圖所示洁闰。作者對(duì)待研究的植物進(jìn)行取樣歉甚，如擬南芥花序、銀杏芽等一些植物進(jìn)行取樣扑眉，切片纸泄，建庫(kù)測(cè)序分析。

4.2分析思路和結(jié)果總結(jié)

1.討論被子植物和裸子植物空間轉(zhuǎn)錄技術(shù)的可行性

a.展示了金銀花的葉子芽在一年四季的形態(tài)腰素；b.金銀花葉子芽?jī)蓚€(gè)發(fā)育中和休眠中的葉芽基因表達(dá)熱圖聘裁，每個(gè)顏色條代表一個(gè)橫截切面，黑色箭頭指示位置表示空間Spots的基因表達(dá)較低弓千；c.展示不同組織切片空間位點(diǎn)PCA的情況衡便，i為雌性錐組織切片Spots PCA；ii 為不同的組織結(jié)構(gòu)（PT/LO）PCA；d.表明每個(gè)Spots的基因和轉(zhuǎn)錄本數(shù)量在擬南芥中復(fù)制镣陕。黑線(xiàn)表示每個(gè)重復(fù)中每個(gè)Spots的平均基因或轉(zhuǎn)錄本的數(shù)量谴餐；由b和c的PCA圖示可以看到空間轉(zhuǎn)錄組信息（Spots）是可以區(qū)分組織差異性的。

2.空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)可用于擬南芥花序分化的分析

a.每個(gè)基因在空間上的表達(dá)水平呆抑。檢測(cè)到基因表達(dá)情況用顏色斑點(diǎn)進(jìn)行表示岂嗓。b.擬南芥空間Spots分層聚類(lèi)（t-SNE分析）。c.微觀(guān)領(lǐng)域級(jí)別的組織域分類(lèi)用于線(xiàn)性模型分析鹊碍。d.組織微類(lèi)別中141個(gè)差異基因檢驗(yàn)水平摄闸。綠點(diǎn)，實(shí)際數(shù)據(jù)中的P值妹萨；紅點(diǎn)年枕，隨機(jī)排列斑點(diǎn)標(biāo)簽后的P值；垂直虛線(xiàn)為排列后的P值的0.1％分位數(shù)（大約等于0.001）乎完，證實(shí)了模型的正確性熏兄，并用于估計(jì)FDR）；水平虛線(xiàn)為任意閾值P（H0）= 0.05树姨。e.列舉線(xiàn)性模型中在組織區(qū)域微類(lèi)別之間的差異表達(dá)基因摩桶。f.花序組織區(qū)域功能通路上的189個(gè)差異基因。顏色編碼如d中所示帽揪。g.線(xiàn)性模型檢測(cè)到的功能通路的例子硝清。由擬南芥的研究可以知道空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)識(shí)別了141個(gè)表達(dá)差異基因和花序組織區(qū)域的功能通路上的189個(gè)差異基因∽空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)結(jié)合功能學(xué)研究芦拿，將有助于更好的理解研究植物的進(jìn)化和發(fā)育。

4.3總結(jié)

這是ST技術(shù)發(fā)表以來(lái)查邢，唯一應(yīng)用于植物學(xué)研究的文章蔗崎，實(shí)際經(jīng)驗(yàn)還不足，尤其植物樣本受到細(xì)胞壁扰藕，液泡缓苛，葉綠體和次生代謝產(chǎn)物的影響，需要對(duì)待研究的樣本進(jìn)行特定的優(yōu)化邓深。

舉一反三的研究思路未桥，加上ST升級(jí)版的10X Genomics Visium ，相信空間轉(zhuǎn)錄組會(huì)得到更廣泛芥备，更深入的應(yīng)用冬耿。

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