八邻辉、右攬雀尾
后坐扣腳 收腳抱球 轉(zhuǎn)體上步 弓步掤臂 擺臂后捋
轉(zhuǎn)體搭手 弓步前擠 轉(zhuǎn)腕分手 后坐引手 弓步前按

單細胞RNA-seq數(shù)據(jù)中的生物異質(zhì)性通常與包括測序深度在內(nèi)的技術(shù)因素混淆。即使在同一細胞類型內(nèi)，每個細胞中檢測到的分子數(shù)量也可能在細胞之間發(fā)生顯著變化囱修。對scRNA-seq數(shù)據(jù)的解釋需要有效的預(yù)處理和標準化想诅，以消除這種技術(shù)差異。在Hafemeister和Satija雁比，2019年稚虎，我們引入了一個建某纺郏框架偎捎，用于對來自scRNA-seq實驗的分子計數(shù)數(shù)據(jù)進行歸一化和方差穩(wěn)定化。此過程省略了對包括偽計數(shù)加法或?qū)?shù)轉(zhuǎn)換在內(nèi)的啟發(fā)式步驟的需要序攘，并改善了常見的下游分析任務(wù)茴她，例如可變基因選擇，降維和差異表達程奠。

在此插圖中丈牢，我們演示了與對數(shù)歸一化相比，使用基于sctransform的歸一化如何能夠恢復(fù)更清晰的生物學(xué)區(qū)別瞄沙。

library(Seurat)
library(ggplot2)
library(sctransform)

加載數(shù)據(jù)并創(chuàng)建Seurat對象

pbmc_data <- Read10X(data.dir = "../data/pbmc3k/filtered_gene_bc_matrices/hg19/")
pbmc <- CreateSeuratObject(counts = pbmc_data)

應(yīng)用sctransform規(guī)范化

• 請注意己沛，這個單一命令替換NormalizeData()，ScaleData()和FindVariableFeatures()`距境。
• 轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)將在SCT分析中提供申尼，運行sctransform后將其設(shè)置為默認值
• 在標準化期間，我們還可以刪除混雜的變異源垫桂，例如線粒體作圖百分比

# store mitochondrial percentage in object meta data
pbmc <- PercentageFeatureSet(pbmc, pattern = "^MT-", col.name = "percent.mt")

# run sctransform
pbmc <- SCTransform(pbmc, vars.to.regress = "percent.mt", verbose = FALSE)

最新版本sctransform還支持使用glmGamPoi軟件包师幕，從而大大提高了學(xué)習(xí)過程的速度∥芴玻可以通過指定調(diào)用它method="glmGamPoi"霹粥。

if (!requireNamespace("BiocManager", quietly = TRUE)) install.packages("BiocManager")

BiocManager::install("glmGamPoi")
pbmc <- SCTransform(pbmc, method = "glmGamPoi", vars.to.regress = "percent.mt", verbose = FALSE)

通過PCA和UMAP嵌入執(zhí)行降維

# These are now standard steps in the Seurat workflow for visualization and clustering
pbmc <- RunPCA(pbmc, verbose = FALSE)
pbmc <- RunUMAP(pbmc, dims = 1:30, verbose = FALSE)

pbmc <- FindNeighbors(pbmc, dims = 1:30, verbose = FALSE)
pbmc <- FindClusters(pbmc, verbose = FALSE)
DimPlot(pbmc, label = TRUE) + NoLegend()

image

在標準的Seurat工作流程中，我們重點關(guān)注此數(shù)據(jù)集的10個PC疼鸟，盡管我們強調(diào)指出后控，此參數(shù)的設(shè)置較高時，結(jié)果相似空镜。有趣的是浩淘，我們發(fā)現(xiàn)使用sctransform時，通彻昧眩可以通過將此參數(shù)推得更高來受益馋袜。我們認為這是因為sctransform工作流程執(zhí)行了更有效的規(guī)范化，從而從數(shù)據(jù)中強烈消除了技術(shù)影響舶斧。

即使經(jīng)過標準的對數(shù)歸一化后欣鳖，測序深度的變化仍然是一個混雜因素（請參見圖1），并且這種影響會微妙地影響更高的PC茴厉。在sctransform中泽台，此效果已大大減輕（請參見圖3）什荣。這意味著更高的PC更可能代表微妙的但與生物學(xué)相關(guān)的異質(zhì)性來源-因此包括它們可能會改善下游分析。

此外怀酷，默認情況下稻爬，sctransform返回3,000個可變功能，而不是2,000蜕依∥Τ基本原理相似，其他可變特征不太可能受細胞間技術(shù)差異的驅(qū)動样眠，而可能代表更微妙的生物學(xué)波動友瘤。通常，我們發(fā)現(xiàn)用sctransform生成的結(jié)果對這些參數(shù)的依賴性較虚苁（實際上辫秧，在轉(zhuǎn)錄組中使用所有基因時，我們獲得了幾乎相同的結(jié)果被丧，盡管這確實降低了計算效率）盟戏。這可以幫助用戶生成更可靠的結(jié)果，此外甥桂，還可以使用具有相同參數(shù)設(shè)置的標準分析管道進行應(yīng)用柿究，這些參數(shù)設(shè)置可以快速應(yīng)用于新的數(shù)據(jù)集：

例如，以下代碼在一個命令中復(fù)制了完整的端到端工作流程：

pbmc <- CreateSeuratObject(pbmc_data) %>% PercentageFeatureSet(pattern = "^MT-", col.name = "percent.mt") %>% 
    SCTransform(vars.to.regress = "percent.mt") %>% RunPCA() %>% FindNeighbors(dims = 1:30) %>% 
    RunUMAP(dims = 1:30) %>% FindClusters()

如我們的論文所述格嘁，sctransform使用“正負二項式回歸”計算scRNA-seq數(shù)據(jù)中的技術(shù)噪聲模型笛求。該模型的殘差為歸一化值，可以為正或負糕簿。給定細胞中給定基因的正殘基表明探入，與基因在種群和細胞測序深度中的平均表達相比，我們觀察到的UMI比預(yù)期多懂诗，而負殘基則相反蜂嗽。

sctransfrom的結(jié)果存儲在“ SCT”分析中。您可以在我們的插圖殃恒，命令備忘單或開發(fā)人員指南中了解有關(guān)Seurat中多測定數(shù)據(jù)和命令的更多信息植旧。

• pbmc[["SCT"]]@scale.data包含殘差（歸一化值），并直接用作PCA的輸入离唐。請注意病附，此矩陣是非稀疏的，因此如果為所有基因存儲亥鬓，可能會占用大量內(nèi)存完沪。為了節(jié)省內(nèi)存，我們僅通過在SCTransform()`函數(shù)調(diào)用中默認設(shè)置return.only.var.genes = TRUE來為變量基因存儲這些值。

• 協(xié)助進行可視化和解釋覆积。我們還將Pearson殘差轉(zhuǎn)換回“校正”的UMI計數(shù)听皿。您可以將它們解釋為如果所有單元格都測序到相同深度，我們期望觀察到的UMI計數(shù)宽档。如果您想確切了解我們?nèi)绾螆?zhí)行此操作尉姨，請在此處查看正確的功能。

• “更正后的” UMI計數(shù)存儲在中pbmc[["SCT"]]@counts吗冤。我們將這些校正后的計數(shù)的對數(shù)標準化版本存儲在中pbmc[["SCT"]]@data又厉，這對可視化非常有幫助。

• 您可以將校正后的對數(shù)歸一化計數(shù)用于差異表達和積分欣孤。但是馋没，原則上，最好直接對（存儲在scale.data插槽中的）殘差本身執(zhí)行這些計算降传。Seurat v3當前不支持此功能，但很快就會支持勾怒。

• • *</details>

用戶可以基于規(guī)范標記單獨注釋集群婆排。但是，與標準的Seurat工作流程相比笔链，sctransform歸一化方法在生物學(xué)上有更明顯的區(qū)別段只，其中包括：

• 基于CD8A，GZMK鉴扫，CCL5赞枕，GZMK表達，至少3個CD8 T細胞群體（幼稚坪创，記憶炕婶，效應(yīng)子）的清晰分離
• 基于S100A4，CCR7莱预，IL32和ISG15的三個CD4 T細胞群體（天然柠掂，記憶，IFN激活）的清晰分離
• 基于TCL1A依沮，F(xiàn)CER2的B細胞簇中的其他發(fā)育子結(jié)構(gòu)
• 根據(jù)XCL1和FCGR3A涯贞，將NK細胞進一步分離為CD56dim與明亮簇

# These are now standard steps in the Seurat workflow for visualization and clustering Visualize
# canonical marker genes as violin plots.
VlnPlot(pbmc, features = c("CD8A", "GZMK", "CCL5", "S100A4", "ANXA1", "CCR7", "ISG15", "CD3D"), 
    pt.size = 0.2, ncol = 4)

image

# Visualize canonical marker genes on the sctransform embedding.
FeaturePlot(pbmc, features = c("CD8A", "GZMK", "CCL5", "S100A4", "ANXA1", "CCR7"), pt.size = 0.2, 
    ncol = 3)

image

FeaturePlot(pbmc, features = c("CD3D", "ISG15", "TCL1A", "FCER2", "XCL1", "FCGR3A"), pt.size = 0.2, 
    ncol = 3)

image

說明一個樣本也可以使用sctransform處理的。