我為什么寫這篇文章？
Taq DNA聚合酶是第一代熱穩(wěn)性的DNA聚合酶潘酗，說實話我覺得Taq DNA聚合酶確實“老了”路幸，應(yīng)該被更優(yōu)秀的“后來者”替代姨涡，在有些領(lǐng)域也確實如此，這是技術(shù)進步的必然哎榴，沒什么可惜的。但是，人們似乎對“第一代”總有一種特別的眷戀酸些，Taq DNA聚合酶從沒出現(xiàn)過“將被淘汰”的危機。野生型的Taq確實失去了光環(huán)檐蚜，但各種各樣的突變體“前赴后繼”魄懂，繼續(xù)在現(xiàn)代生物學(xué)領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用。本文是出于個人的興趣闯第，對Taq DNA聚合酶作了一個綜述性回顧市栗，即致敬那些為Taq DNA聚合酶的應(yīng)用和拓展作出卓越貢獻的科研人員，也為Taq DNA聚合酶研發(fā)同行提供一個參考咳短。本文羅列了一些Taq DNA聚合酶的突變體填帽，它們都在某些方面被賦予更”好“的性能，文末提供了這些突變體的序列咙好，點擊直達篡腌。

引言

1986年，Mullis先生正式公布了PCR技術(shù)的論文（Mullis, 1986）勾效，從此開啟了現(xiàn)代分子生物學(xué)的大門嘹悼。當(dāng)時，由于使用的是大腸桿菌聚合酶I（Klenow）层宫，每個循環(huán)都需要補充新的聚合酶杨伙，操作十分麻煩。1988年萌腿，Saiki等（Saiki, 1988）將一種從Thermus aquaticm分離出的耐熱型DNA 聚合酶用于PCR技術(shù)限匣，成功完成了DNA的自動擴增，這個聚合酶就是“大名鼎鼎”的Taq DNA聚合酶哮奇。Taq DNA聚合酶的發(fā)現(xiàn)膛腐，使PCR變成一種便利的睛约、普遍的實用分子生物學(xué)技術(shù)。

30多年來哲身，越來越多的其它的優(yōu)秀的耐熱型DNA聚合酶用于PCR技術(shù)辩涝，比如Pfu系列、Vent系列勘天、KOD系列怔揩，但Taq DNA聚合酶始終是PCR聚合酶的主力軍。到目前脯丝，Taq仍然是市場份額最大商膊，種類最繁多，應(yīng)用最廣泛的熱穩(wěn)型DNA聚合酶宠进。Taq聚合酶缺乏3’-5’校正活性晕拆，但具有5’-3’外切活性和末端加A的特點，在sanger測序材蹬、qPCR实幕、TA克隆等領(lǐng)域具有獨特的應(yīng)用。同時堤器，研究人員對Taq DNA聚合酶的改造也從未停止昆庇，這正是Taq DNA聚合酶在PCR應(yīng)用中生生不息的根本動力。下面闸溃，我就來介紹一下Taq DNA聚合酶的應(yīng)用及改造歷程整吆。

Taq DNA 聚合酶的來源

Taq DNA聚合酶是從一種叫做水生棲熱菌（Thermus aquaticus）的嗜熱細菌中分離出來的（Chien, 1976），這種細菌是從美國黃石國家森林公園的火山溫泉中分離得到的辉川，生長在70-75℃極富礦物質(zhì)的高溫環(huán)境中（Brock, 1969）表蝙。因此，Taq DNA聚合酶具有極高的熱穩(wěn)定性乓旗，或許能夠承受PCR的熱變性步驟勇哗。1988年，Saiki等將Taq DNA聚合酶用于體外PCR擴增寸齐，不但實現(xiàn)了PCR自動化，還因為提高了退火和延伸溫度而提高了產(chǎn)物特異性抄谐。這個研究鼓勵了更多的技術(shù)人員使用Taq DNA聚合酶進行PCR渺鹦，1989年，Lawyer等利用特異性探針從Taq DNA聚合酶基因文庫中釣取了Taq DNA聚合酶全長基因蛹含，最終得到一個2499bp的編碼序列毅厚，GC%高達68%，他們將該基因克隆到大腸桿菌中浦箱，通過誘導(dǎo)表達和分離純化得到純的Taq DNA聚合酶吸耿。

Taq DNA 聚合酶的特點

Taq DNA聚合酶全長832aa祠锣，相對分子量94KD，預(yù)測的等電點約為6.0咽安，理論總平均親水指數(shù)為-0.282“橥現(xiàn)將其酶學(xué)特點羅列如下：

① 良好的耐熱型，最適催化溫度在75-80℃妆棒，95℃半小時后仍保留50%以上的活性澡腾。Taq DNA聚合酶是Mg²⁺依賴型聚合酶，最適濃度范圍是2-4mM糕珊。Taq DNA聚合酶還需要單價陽離子动分，在10-55 mM KCl中具有最大活性。有研究認(rèn)為Na⁺會抑制聚合酶活性红选，但有些研究中聚合酶在Na⁺環(huán)境中也能夠正常擴增澜公。

② 5'-3'聚合活性，該特性對溫度具有較高的敏感性喇肋，70℃時坟乾，Taq DNA聚合酶能夠以60nt/s的速率聚合DNA鏈，55℃時降為24nt/s苟蹈，37℃時為1.5nt/s糊渊，22℃時基本停止擴增（Innis, 1988）。

③ 5'-3'外切核酸酶活性慧脱，Taq DNA聚合酶是少數(shù)具有這一活性的DNA聚合酶之一渺绒。1991年，Holland等（Holland, 1991）利用Taq DNA聚合酶的5'-3'外切活性切除5’端放射性標(biāo)記的DNA探針菱鸥，通過放射性信號的變化宗兼，實現(xiàn)PCR產(chǎn)物的特異性檢測。這一研究，為qPCR技術(shù)的發(fā)展奠定了基礎(chǔ)登钥，從此轮纫，Taq DNA聚合酶也成了探針法qPCR技術(shù)的指定聚合酶情连。

④ 部分PCR產(chǎn)物3’末端加A啡氢，1988年，Clark等發(fā)現(xiàn)Taq DNA聚合酶會在新生鏈的3’末端添加無模板核苷酸，這一特征使Taq DNA聚合酶的PCR產(chǎn)物能夠直接用于TA克隆码俩。但是實際應(yīng)用時袖迎，情況要復(fù)雜得多， 1993年腺晾，Hu等報道了8種聚合酶3’末端延伸的情況燕锥，發(fā)現(xiàn)Taq DNA聚合酶在PCR產(chǎn)物的3’末端添加A或其它堿基。1996年悯蝉，Magnuson等系統(tǒng)性研究了Taq DNA聚合酶3’末端加A的概率归形，發(fā)現(xiàn)3’末端加A并不高，與反向引物5’端堿基種類密切相關(guān)鼻由，他們還指出這種不完全的堿基添加不利于在等位基因分形和TA克隆暇榴。

⑤ 無3'-5'校正活性，雖然Taq DNA聚合酶與大腸桿菌聚合酶I有很高的結(jié)構(gòu)相似性（包括3’-5’外切核酸酶結(jié)構(gòu)域）嗡靡，但它缺乏3'-5'外切核酸酶活性跺撼，這降低了其在PCR擴增中的忠實性。關(guān)于Taq DNA聚合酶的錯誤率讨彼，不同的報道差異很大歉井，Tindall等（Tindall, 1988）測定的突變率為1/9000，Cline等（Cline, 1996）測定的突變率為8.0±3.9×10^-6哈误。這種差異的原因有兩個：一哩至、測試方法不同，比如lacZα和lacI蜜自，二菩貌、酶純度和實驗條件有差異。拋開這些錯誤率數(shù)據(jù)重荠，實事求是的講箭阶，我使用Taq DNA聚合酶多年，用于一般性擴增保真性還可以，一般1-2.5kb的目標(biāo)片段仇参，挑取兩個克隆基本能得到正確的克隆嘹叫。用于困難模板擴增時，錯誤率較高诈乒，挑取4-6個克隆子基本也能得到正確克隆罩扇。

(上述所列的酶的催化性能參數(shù)，在不同的研究中是有較大變化怕磨，因為可能使用的酶純度不同喂饥，或者使用的buffer不同，模板肠鲫、引物员帮、儀器、反應(yīng)體系甚至PCR管壁的薄厚都會導(dǎo)致PCR表現(xiàn)的差異滩届。這些數(shù)據(jù)只是一個參考集侯，實際使用中應(yīng)以試驗結(jié)果為準(zhǔn)。)

Taq DNA 聚合酶的結(jié)構(gòu)與功能

Taq DNA聚合酶屬于聚合酶家族A帜消，是一個單體酶棠枉，它與大腸桿菌聚合酶I（pol I）具有很高的結(jié)構(gòu)同源性。1995年泡挺，Kim等公布了Taq DNA聚合酶的晶體結(jié)構(gòu)辈讶，為解釋其耐熱性、催化活性及分子改造奠定了基礎(chǔ)娄猫，下面將其結(jié)構(gòu)特點羅列如下：

Taq DNA聚合酶的三維結(jié)構(gòu)（Kim, 1995）

① Taq DNA聚合酶包括三個結(jié)構(gòu)域贱除，1-291：5'-3'外切核酸酶結(jié)構(gòu)域，292-423：該結(jié)構(gòu)域?qū)?yīng)于pol I的3'-5'外切酶結(jié)構(gòu)域媳溺，兩者雖然具有結(jié)構(gòu)相似性但無序列同源性月幌，因此Taq DNA聚合酶不具有3'-5'外切活性，424-832：5'-3'聚合活性結(jié)構(gòu)域悬蔽。

② 5'-3'外切結(jié)構(gòu)域是一個功能完整的獨立結(jié)構(gòu)域扯躺，該結(jié)構(gòu)域的缺失不會使Taq喪失聚合活性，但對酶的催化性能有一些影響蝎困。Barnes（Barnes, 1992）構(gòu)建了一個N端236aa缺失的Taq突變體录语，發(fā)現(xiàn)仍具有完整的聚合活性，且保真性有所提高禾乘。Lawyer等（Lawyer, 1993）發(fā)現(xiàn)N端289aa缺失的大片段耐熱性比全長酶更高澎埠，且鹽離子耐受能力也提高了，但持續(xù)合成活性降低十倍始藕。Merkens等（Merkens, 1995）認(rèn)為Klentaq持續(xù)合成能力的下降與5'-3'外切結(jié)構(gòu)域結(jié)合DNA有關(guān)蒲稳，結(jié)合作用阻止了酶與DNA底物的徹底解離氮趋，后來很多研究人員也支持這一觀點。此外弟塞，5'-3'結(jié)構(gòu)域還對Taq DNA聚合酶的底物特異性有很大影響凭峡，5'-3'結(jié)構(gòu)域刪除片段對引物3’端錯配敏感性顯著下降，對ddNTP的摻入能力增強决记。從三維結(jié)構(gòu)上看外切結(jié)構(gòu)域與聚合結(jié)構(gòu)域距離很遠（大于70?），很難理解它是如何與聚合結(jié)構(gòu)域協(xié)作的倍踪，Kim等也無法解釋這個現(xiàn)象系宫，他們推測5'-3'外切結(jié)構(gòu)域在溶液中的位置與晶體中不同，要更接近聚合結(jié)構(gòu)域建车。

③ Taq DNA聚合酶3'-5'外切酶結(jié)構(gòu)域比pol I短扩借，缺少4個長度8-27aa的loop結(jié)構(gòu)，并且pol I中擔(dān)負(fù)金屬離子結(jié)合的關(guān)鍵殘基D424缤至、D501潮罪、D355、E357在Taq中被替換為L356领斥、R405嫉到、G308、V310月洛，酸性殘基上的羧基能夠與金屬離子形成離子鍵何恶，被替換后無法再與金屬離子結(jié)合，Kim等推測這是Taq DNA聚合酶失去3'-5'外切酶活性的主要原因嚼黔。

（Eom S H, 1996）Klentaq1-DNA復(fù)合物結(jié)構(gòu)

Taq DNA聚合酶的應(yīng)用

PCR技術(shù)改變了現(xiàn)代分子生物學(xué)钓株，而Taq DNA聚合酶改變了PCR实牡。隨著技術(shù)不斷的發(fā)展，PCR又細分為功能各異的種類轴合，分別應(yīng)用于不同的領(lǐng)域创坞。在有些領(lǐng)域，比如高保真擴增受葛，Taq DNA聚合酶被具有校正活性的酶取代题涨，有些領(lǐng)域偎谁，如直接PCR、等位基因檢測等領(lǐng)域纲堵，Taq DNA聚合酶還具有重要的應(yīng)用巡雨，還有些領(lǐng)域，如Sanger測序席函、探針法qPCR铐望、TA克隆，Taq DNA聚合酶仍不可替代茂附，下面我就列舉幾個介紹一下正蛙。

• 熱循環(huán)PCR
  Taq DNA聚合酶具有良好的熱穩(wěn)定性，能夠承受熱循環(huán)PCR的溫度變化营曼，不需要再人為的補充聚合酶乒验，有利于自動化擴增，并且可以在較高溫度下進行退火和延伸蒂阱，能夠提高PCR的特異性锻全，因此被廣泛采用。隨著越來越多的其他來源的DNA聚合酶被發(fā)現(xiàn)录煤，Taq DNA聚合酶受到了嚴(yán)重的沖擊鳄厌，不過由于Taq DNA聚合酶廉價易得，產(chǎn)品種類齊全辐赞，在一般的檢測性PCR部翘，插入基因鑒定，基因編輯檢測等領(lǐng)域响委，仍具有十分廣泛的應(yīng)用新思。

• 易錯PCR
  易錯PCR是一種常用的基因隨機突變方法，在酶的分子改造領(lǐng)域具有重要應(yīng)用赘风。聚合酶在高濃度Mg²⁺或者Mn²⁺存在條件下夹囚，延伸錯誤率概率顯著提高，所得目標(biāo)產(chǎn)物形成含有隨機突變的DNA文庫邀窃。Taq DNA聚合酶因為缺乏3’-5’校正活性荸哟，正適合易錯PCR技術(shù)，雖然通過功能結(jié)構(gòu)域缺失瞬捕，Pfu(exo-)鞍历、Vent(exo-)也可以應(yīng)用于易錯PCR，但大多數(shù)報道中都采用Taq DNA聚合酶肪虎。

• 熱啟動PCR
  利用Taq DNA聚合酶進行PCR時劣砍，在較低的溫度下（20-40℃）酶仍具有一定的聚合活性，此時引物容易非特性退火扇救，因此容易產(chǎn)生干擾產(chǎn)物刑枝，甚至導(dǎo)致目標(biāo)序列擴增失敗香嗓。1991年，D'Aquila等發(fā)現(xiàn)將PCR試劑與模板分別加熱到較高溫度再混合装畅，能夠提高PCR產(chǎn)量及專一性靠娱，為熱啟動PCR奠定了基礎(chǔ)。1994年掠兄，Sharkey等（Sharkey, 1994;Scalice, 1994）發(fā)現(xiàn)一種抗體TP7像云，能夠在低溫下抑制Taq DNA聚合酶，高溫變性后完全釋放出Taq DNA聚合酶的活性蚂夕，明顯降低了非特性擴增的發(fā)生苫费。后來，研究人員又發(fā)現(xiàn)了冷敏感的Taq DNA聚合酶突變體双抽，在低溫下活性極低，高溫下又能夠正常擴增闲礼。研究人員還發(fā)明了類發(fā)卡引物牍汹、雙鏈引物、熱活性引物柬泽，避免引物提前退火慎菲，進一步減少了PCR 的非特異性擴增。Taq DNA聚合酶熱啟動產(chǎn)品锨并，目前在市場上還有很大占比露该，而且為其他DNA聚合酶的同類產(chǎn)品研發(fā)提供了思路。

• 位點特異性PCR（SNP檢測）
  3’-5’校正活性的缺失限制了Taq DNA聚合酶的應(yīng)用第煮，但這種缺陷使Taq DNA聚合酶正好可以用在單核苷酸多態(tài)性（SNP）檢測上解幼。1992年，Huang等發(fā)現(xiàn)Taq DNA聚合酶因為缺乏3’-5’校正活性包警，在擴增3’端錯配引物時撵摆，效率顯著降低（見下圖）。

  
  
  （Huang M M, 1992）引物/模板錯配（橫坐標(biāo)）與延伸效率（縱坐標(biāo)）

  在進行SNP檢測時害晦，只要把引物3’端設(shè)計在等位基因處特铝，匹配的模板能夠正常擴增，不匹配的模板就無法擴增或產(chǎn)量很低壹瘟，根據(jù)核酸電泳或者qPCR檢測鲫剿，進行基因型區(qū)分。不過這種方法也有缺陷稻轨，雖然有些錯配（比如A/C灵莲、T/G）延伸效率降低，但仍能產(chǎn)生PCR產(chǎn)物澄者，干擾檢測結(jié)果笆呆，研究人員對此進行了一系列的改進優(yōu)化请琳，準(zhǔn)確性得到了很大的改善（Ahmadian, 2001; Germer, 2003; Gaudet, 2009）。不過由于測序技術(shù)的普及赠幕，用測序法進行基因分型和SNP檢測更加準(zhǔn)確俄精，但更高的成本、耗時等缺陷還是有一定限制榕堰，基于Taq DNA聚合酶的PCR/qPCR試劑盒在該領(lǐng)域發(fā)揮著主要作用竖慧。

• qPCR（Taqman法）
  

  qPCR按照檢測模式的不同可以分為熒光染料法、Taqman探針逆屡、分子信標(biāo)和雙雜交探針圾旨，分子信標(biāo)本質(zhì)上也是一種探針盔然，本文將其和Taqman統(tǒng)稱為探針衰伯。熒光染料法是基于SYBR green I與dsDNA的無差別結(jié)合，因此(SYBR)qPCR對DNA聚合酶基本沒有要求氨肌，探針法基于聚合酶5’-3’外切活性對5’端熒光報告基團的切割莺治，因此只能用Taq及其衍生酶廓鞠。
  （Taqman）qPCR與（SYBR）qPCR的區(qū)別

• TA克隆
  向PCR產(chǎn)物3’端無模板依賴添加脫氧核糖核苷酸不是Taq DNA聚合酶特有的性質(zhì)，測序酶谣旁、pol I（強）床佳，Vent（弱）都有這個特點，但適合耐熱性PCR的只有Taq系列榄审。前面已經(jīng)做過介紹砌们，Taq DNA聚合酶3’末端加的不一定都是A，而且概率也不高搁进，跟反向引物的5’端堿基有關(guān)浪感，但PCR產(chǎn)生的巨大數(shù)量的拷貝能夠確保每一種基因型產(chǎn)物都得到有效克隆，在TA克隆應(yīng)用上Taq DNA聚合酶仍然無法替代拷获。

• Sanger測序
  Sanger測序又稱第一代DNA測序篮撑，其特點是通過摻入ddNTP使DNA鏈終止延伸，產(chǎn)生不同斷點的條帶匆瓜，經(jīng)過凝膠電泳分析赢笨，即可確定四種堿基在DNA鏈中位置。1977年驮吱，Sanger先生使用該技術(shù)完成了一個五千多堿基對的DNA序列測定茧妒，開啟了核酸測序的新時代。
  
  Sanger最早的測序酶是大腸桿菌pol I Klenow片段左冬，效果并不太好桐筏，后來發(fā)現(xiàn)了來源于T7噬菌體的T7 DNA聚合酶，它摻入ddNTPs的能力比pol I和Taq優(yōu)秀的多拇砰，通過氨基酸刪除降低其3’-5’外切活性梅忌，具有極高的持續(xù)合成能力狰腌，是一個優(yōu)秀的測序酶（Tabor, 1987; Tabor, 1995）。但是T7 DNA聚合酶是一個常溫酶牧氮，不適合耐熱型PCR琼腔，特異性不好。研究人員自然想到了耐熱的Taq DNA聚合酶踱葛，然而野生Taq酶在Sanger測序中的表現(xiàn)并不理想丹莲，主要有兩個問題：1.野生型Taq摻入ddNTP的活性很低，無法產(chǎn)生足夠強度的測序譜帶尸诽。2.摻入ddNTP的速率不均勻甥材，Taq野生酶及突變體極顯著的偏好ddGTP摻入。
  
  第一個問題率先被Reeve等（Reeve, 1995）解決性含，他們發(fā)現(xiàn)位于O-α螺旋（該結(jié)構(gòu)處于活性口袋區(qū)洲赵，一般活性口袋的苯環(huán)結(jié)構(gòu)都是值得關(guān)注的殘基）中的F667對ddNTP摻入十分重要，F(xiàn)667Y顯著提高了酶的ddNTP摻入能力商蕴。后來板鬓，Vander等（Vander, 1997）將Klentaq(F667Y)突變體與一種耐熱型無機焦磷酸酶配合，測序性能更加優(yōu)秀究恤。不知道Life公司大名鼎鼎的BigDye是不是在此基礎(chǔ)上研發(fā)的，BigDye中的ddNTP是被不同的熒光染料標(biāo)記的后德，比ddNTP具有更大的空間位阻部宿，可能需要更多的突變。第二個問題瓢湃，1998年被Li等（Li, 1998; Li, 1999）解決理张，為了調(diào)查摻入ddGTP偏好的原因，他們結(jié)晶了Klentaq1-DNA-ddNTP三元復(fù)合物绵患。數(shù)據(jù)揭示了精氨酸殘基660（R660）的胍基側(cè)鏈與傳入的ddGTP的鳥嘌呤堿基的O6/N7原子之間的選擇性相互作用雾叭，用帶負(fù)電荷的天冬氨酸取代R660殘基完全消除了ddGTP摻入的偏好，R660D/F667Y雙突變體大大提高了染料終止法的測序質(zhì)量和準(zhǔn)確性落蝙。

  Vander Horn P B, 1997
  大腸桿菌pol I是第一代Sanger測序酶织狐，存在較多缺陷，因此很快被取代筏勒；T7 DNA聚合酶是第二代移迫，測序表現(xiàn)比較優(yōu)秀，也曾閃亮一時管行；Taq DNA聚合酶是第三代厨埋，因其熱穩(wěn)定性成為最有潛力的測序酶，經(jīng)過不斷的改造和進化捐顷，Taq已經(jīng)成為成熟的商業(yè)化測序酶荡陷，并長期“霸占”Sanger測序領(lǐng)域雨效。

• 二代測序
  二代測序又稱下一代測序（NGS），是近十幾年迅速發(fā)展起來的一種測序技術(shù)废赞，2014年開始風(fēng)靡中國徽龟，勢頭很猛，大有取代Sanger測序的趨勢蛹头，但Sanger測序仍發(fā)揮著不可替代的作用顿肺。NGS取得了巨大成功，就像illumina公司的Chen Cheng-Yao（Chen, 2014）說的渣蜗，NGS技術(shù)徹底改變了現(xiàn)代生物學(xué)和生物醫(yī)學(xué)研究屠尊，負(fù)責(zé)這項創(chuàng)新的引擎就是DNA聚合酶。DNA聚合酶在NGS技術(shù)中的應(yīng)用包括兩個方面：1耕拷、作為測序酶讼昆，2、作為建庫試劑骚烧。

  （Guo J, 2010）在SBS方法中浸赫，使用固定化的DNA模板構(gòu)建芯片，該模板能夠自引發(fā)聚合酶反應(yīng)赃绊。設(shè)計了四個核苷酸類似物既峡，使得每個核苷酸類似物在堿基的特定位置上都標(biāo)記有獨特的熒光染料，并具有一個小的化學(xué)基團（R）來封端3'-OH基團碧查。加入四個核苷酸類似物和DNA聚合酶后运敢，聚合酶僅將與模板上下一個核苷酸互補的核苷酸類似物摻入芯片的每個斑點上（步驟1）。去除多余的試劑并洗掉所有未結(jié)合的核苷酸類似物后忠售，使用四色熒光成像儀對芯片表面進行成像传惠，并在芯片的每個點上從核苷酸類似物上的特定染料發(fā)出獨特的熒光發(fā)射將產(chǎn)生核苷酸的身份（步驟2）。成像后稻扬，自引發(fā)模板部分上的少量未反應(yīng)的3'-OH基團將被過量的3'-O-修飾的核苷酸可逆終止子和DNA聚合酶封閉卦方，以避免干擾下一輪合成（步驟3）。染料部分和R保護基將被去除泰佳，以高產(chǎn)率產(chǎn)生游離的3'-OH基（步驟4）盼砍。通過重復(fù)步驟1、2逝她、3和4以鑒定模板DNA的下一個核苷酸序列衬廷，在此階段，芯片上的自引發(fā)DNA部分準(zhǔn)備用于下一個反應(yīng)周期汽绢。
  NGS技術(shù)的特點是邊合成邊測序（SBS）吗跋，它使用一種可逆的的染料終止劑（脫氧核糖的3'-OH位置與熒光團之間，包含可裂解的化學(xué)基團，熒光信號被采集后通過化學(xué)方法去除熒光基團跌宛，新暴露的3'-OH能夠繼續(xù)聚合堿基）酗宋，在測序過程中可以被清除，不會終止延伸反應(yīng)疆拘。Klentaq(R660D/F667Y)突變體對這種染料活性不高蜕猫，所以適用于Sanger測序的Taq酶并不適合NGS。NGS早期采用的是 9^oN polymerase(exo-) A485L/Y409V突變體哎迄。不過回右，科研人員并沒有放棄Taq DNA聚合酶，Leconte等（Leconte, 2010）通過定向進化得到一個突變體Taq 197漱挚，摻入可逆性標(biāo)記脫氧核糖核苷酸的能力比Klentaq突變體顯著提高翔烁。Chen等（Chen F, 2010）通過定向進化得到一個突變體，摻入dNTP-ONH2能力顯著提高旨涝。遺憾的是Taq DNA聚合酶最終并沒有被廣泛用于NGS蹬屹。
  
  文庫構(gòu)建是NGS技術(shù)中最重要的步驟，而構(gòu)建文庫最重要的酶就是DNA聚合酶白华。建庫要求酶具有極高的均一性和擴增效率慨默，能夠擴增高GC、高AT等復(fù)雜模板弧腥，WGS/WES厦取、變異檢測等對保真性也有較高要求。在這個方面管搪，Taq DNA聚合酶依然沒有Vent蒜胖、Pfu、KOD等保真酶應(yīng)用廣泛抛蚤。在特殊的測序領(lǐng)域，如甲基化測序寻狂，DNA經(jīng)過重亞硫酸鹽在高溫岁经、酸性條件下轉(zhuǎn)化后會產(chǎn)生dC-dU堿基變換和堿基損傷，保真酶難以擴增蛇券，Taq DNA聚合酶成了不錯的選擇缀壤。Millar等（Millar, 2015）通過定向進化得到一個突變體5D4，能夠繞過重亞硫酸鹽處理DNA的dU堿基和損傷堿基纠亚。當(dāng)然Pfu(exo-)等通過定向進化在這方面也取得了成功塘慕，因此對于NGS技術(shù)，Taq DNA聚合酶的應(yīng)用并不普遍蒂胞。至于第三代新型測序技術(shù)图呢，主要以φ29 DNA聚合酶為主導(dǎo)，Taq DNA聚合酶在新興測序領(lǐng)域似乎漸漸沒落了。

Taq DNA聚合酶的改造

Taq DNA聚合酶發(fā)現(xiàn)了幾十年蛤织，不但沒有被取代赴叹，反而在分子生物學(xué)領(lǐng)域具有越來越廣泛的應(yīng)用。這一方面依賴于它自身的功能和特點指蚜，另一方面也依賴于研究人員對其不斷的進化與改造乞巧。通過定點突變、結(jié)構(gòu)域重組摊鸡、定向進化等技術(shù)绽媒，Taq DNA聚合酶獲得了許多催化性能改善或展現(xiàn)新功能的突變體，拓寬了酶的應(yīng)用范圍免猾，下面就來做一個回顧是辕。

• 通過理性設(shè)計得到的突變體
  ①缺失突變體。Taq DNA聚合酶的第一個突變體就是N端刪除大片段了掸刊，根據(jù)刪除長度的差異免糕，有不同的名稱：KlenTaq(?236)（Barnes, 1992），Klentaq1(?280)（U.S. Patent 5436149）忧侧，Stoffel(?289)（Lawyer, 1993）石窑，它們本質(zhì)上是一樣的，都是5’-3’外切結(jié)構(gòu)域缺失的突變體蚓炬。N端刪除Taq的耐熱型松逊、鹽離子耐受能力、保真性都有所提高肯夏，但持續(xù)合成能力顯著下降经宏，對引物3’端錯配的敏感性明顯降低，這說明5’-3’外切結(jié)構(gòu)域?qū)γ傅恼w構(gòu)象可能有很大的影響驯击。研究人員發(fā)現(xiàn)大腸桿菌pol I后烁兰，又發(fā)現(xiàn)一種N端截短的Klenow片段，后者在DNA擴增上具有更好的表現(xiàn)徊都，因此沪斟，研究人員得到Taq DNA聚合酶后，發(fā)現(xiàn)它與pol I有很多相似之處暇矫，自然而然的會進行這種嘗試主之。根據(jù)結(jié)構(gòu)或功能相似的酶對目標(biāo)酶進行結(jié)構(gòu)域編輯或者氨基酸替換，是一種常用的分子改造策略李根。
  
  ②Sanger測序突變體槽奕。使用Taq作為測序酶時發(fā)現(xiàn)，Taq無法摻入順利ddNTP（除ddGTP）房轿，Tabor等（Tabor, 1995）通過F667Y突變體解決了這個問題粤攒。但是Taq(F667Y)摻入ddNTPs的速率不均勻所森，強烈偏向ddGTP，Li等（1999）在Klentaq1與ddNTP復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上琼讽，對R660殘基進行突變必峰，結(jié)果R660D/F667Y雙突變體摻入ddGTP與其它雙脫氧核糖核苷酸的速率基本一致。根據(jù)酶-底物復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)對酶進行理性設(shè)計是一種常用的酶進化方式钻蹬，當(dāng)然也比較有難度吼蚁，很多時候酶-底物的晶體甚至酶的晶體不易得，即使得到晶體結(jié)構(gòu)问欠，也很難判斷關(guān)鍵的氨基酸肝匆。通常的做法是根據(jù)酶-底物的分子相互作用，掃描活性口袋的氨基酸顺献，這種方法經(jīng)常能在增強底物親和力、拓寬底物譜方面得到滿意的結(jié)果注整。

• 通過定向進化得到的突變體
  定向進化是一種十分強大的酶分子改造技術(shù)，與理性設(shè)計的“所見即所得”不同驹暑，它的的特點是“所篩即所得”玫恳。定向進化允許構(gòu)建龐大的突變體庫，這就讓酶有了各種可能（在自然界中這可能需要幾百萬年以上的時間）优俘，只要找到高效的篩選方法京办，一般都能得到令人驚喜的結(jié)果。構(gòu)建突變體的方法有易錯PCR帆焕、DNA改組惭婿、交錯延伸PCR、體外隨機延伸PCR等视搏，篩選一般包括初篩與復(fù)篩，初篩依靠添加篩選壓力讓目標(biāo)突變體留存下來县袱，復(fù)篩將留存下來的克隆進行性能比較浑娜，從而選出最優(yōu)秀的突變體。篩選的主要壓力來自于初篩式散，必須具有高通量的方法筋遭，因為突變體庫多樣性可達10⁸-10⁹，一般采用與顯色化學(xué)反應(yīng)，酶促反應(yīng)偶聯(lián)產(chǎn)生便于觀察的信號漓滔。
  
  2001年编饺，Ghadessy等報道了一種分區(qū)自我復(fù)制（Compartmentalized Self-replication，CSR）技術(shù)响驴，該技術(shù)通過油水混合透且，形成一個個微小的油包水體系，每個體系就好像一個獨立的隔離室豁鲤，含有攜帶Taq DNA聚合酶突變體的大腸桿菌秽誊、dNTP、PCR buffer和Taq DNA聚合酶的引物琳骡，油包水體系在高溫條件下仍具有很高的穩(wěn)定性锅论，通過預(yù)熱變性，大腸桿菌釋放出Taq DNA聚合酶楣号，通過PCR循環(huán)最易，在篩選壓力條件下，具有高活性的突變體以自身基因為模板進行PCR擴增炫狱，無義突變體被淘汰藻懒，反應(yīng)結(jié)束純化被富集的DNA產(chǎn)物，即得到了優(yōu)秀的突變體基因毕荐。

  （Ghadessy F J, 2001）CSR總體方案束析。 （1）在大腸桿菌中克隆并表達聚合酶基因，球形代表有活性的聚合酶分子憎亚。 （2）將含有聚合酶和編碼基因的細菌細胞懸浮在含有引物和dNTP的反應(yīng)緩沖液中员寇，并分離到水室中。 （3）聚合酶從細胞中釋放出來第美，進行自我復(fù)制蝶锋。 活性低的聚合酶（白色六邊形）無法復(fù)制其編碼基因。釋放后代聚合酶基因并重新克隆什往，以進行另一輪CSR扳缕。
  Ghadessy等得到兩個突變體：T8（F73S, R205K, K219E, M236T, E434D, A608V），在97.5°C下的半衰期提高11倍别威，但催化效率和保真性有所下降躯舔；H15（K225E, E388V, K540R, D578G, N583S, M747R），對高濃度肝素抑制劑抗性提高130倍以上省古，但耐熱性顯著下降粥庄，催化活性也有下降。雖然本次研究沒有得到非常優(yōu)秀的突變體豺妓，但CSR技術(shù)為熱穩(wěn)定DNA聚合酶的定向進化提供了高效篩選方法惜互，這種方法遠比結(jié)果更有意義布讹。
  
  ③熱啟動突變體。Kermekchiev等（Kermekchiev, 2003）以Klentaq為模板训堆，通過易錯PCR得到突變體庫描验，然后利用一種基于放射性dNTP標(biāo)記的在位篩選方法得到一個Klentaq Cs3AC（E626K坑鱼，I707L）突變體膘流，該突變體在37℃時活性明顯降低，但68℃時仍保持正彻枚悖活性睡扬，是一款極具潛力的熱啟動酶。2009年黍析，該團隊在Cs3AC的基礎(chǔ)上對706-708殘基進行飽和掃描突變卖怜，經(jīng)過篩選得到一個突變體Klentaq 10（E626K， I707L阐枣，E708K）马靠，該突變體的全血抑制抗性、土壤抑制抗性蔼两、熒光染料抑制抗性比野生酶都有提高甩鳄，研究人員將三個氨基酸替換平移到全長Taq DNA聚合酶上之后，得到一突變體Taq 22（E626K额划， I707L妙啃，E708Q）抑制劑抗性比野生Taq顯著提高。Taq 22不但獲取了冷敏感特征俊戳，提高了抑制劑抗性揖赴，還保持了野生Taq的熱穩(wěn)定性和催化活性，如果配合TP7抗體抑胎，具有“熱啟動”PCR試劑盒開發(fā)的潛力燥滑。
  
  ④逆轉(zhuǎn)錄活性突變體。野生型Taq DNA聚合酶沒有逆轉(zhuǎn)錄活性阿逃，但Sauter等（Sauter, 2006）以KlenTaq為模板通過易錯PCR和微孔板篩選铭拧，得到兩個個逆轉(zhuǎn)錄活性提高的突變體：KlenTaq M1（L322M，L459M恃锉，S515R搀菩，I638F，S739G破托，E773G）肪跋，KlenTaq M2（L322M，L459M炼团，S515R澎嚣，I638F，S739G瘟芝，E773G易桃，L789F）。為了將這種增強的逆轉(zhuǎn)錄活性用于基于探針的一步法RT-qPCR檢測锌俱，Kranaster等（Kranaster, 2010）將KlenTaq M1的突變平移到全長Taq上晤郑，得到一個新突變體Taq M1，結(jié)果Taq M1即基本保留了野生Taq酶的PCR性能贸宏，又顯著增強了逆轉(zhuǎn)錄活性造寝。Blatter等（Blatter, 2013）進一步將M1的突變與M747K（Gloeckner, 2007）混組，得到一個新突變體RT-KTq2（L459M吭练，S515R诫龙，I638F，M747K）鲫咽，RT-KTq2的逆轉(zhuǎn)錄能力比KlenTaq M1更強签赃，并且DNA模板擴增能力也有所提高。RT-KTq2的高耐熱性有利于提高RT-PCR的特異性分尸，RT-KTq2無RNase H活性锦聊，降低了RNA損傷，因為兼具DNA聚合酶活性箩绍，可以實現(xiàn)了逆轉(zhuǎn)-擴增一酶化孔庭。Blatter等用RT-KTq2對幾個人源基因進行的基于SYBR的RT-qPCR檢測，得到了不錯的擴增曲線材蛛，但作者沒有與商品化MMLV/Taq逆轉(zhuǎn)錄試劑盒對比圆到，如果RT-KTq2能達到或接近MMLV的逆轉(zhuǎn)錄活性，那么RT-KTq2能夠成為一款優(yōu)秀的逆轉(zhuǎn)錄擴增酶仰税。
  
  ⑤抑制劑抗性突變體构资。從各種各樣的樣本中進行核酸檢測，是PCR的一個重要應(yīng)用領(lǐng)域陨簇。一般的流程是吐绵，先從樣本中將核酸提取出來，再用DNA聚合酶進行PCR擴增河绽，最后根據(jù)核酸電泳條帶或者熒光信號等方式觀察擴增結(jié)果己单。有時候，因為樣本的稀有性等原因無法提取DNA耙饰，或者基于檢測時效性和便利性的考慮外邓，我們希望能夠直接從樣本中擴增靶標(biāo)基因数苫，比如血液、動植物組織宝磨、土壤。這些樣本中的復(fù)雜組分可能對DNA聚合酶有很強的抑制作用耸峭，失敗的擴增會造成假陰性的誤判，這促使研究人員通過分子改造提高聚合酶的抑制劑耐受性。野生型Taq DNA聚合酶對血液元暴、土壤等抑制劑的耐受性很差兄猩，N端刪除大片段的耐受性有所提高茉盏，但仍然難以滿足要求。Kermekchiev等（Kermekchiev, 2009）通過定點飽和掃描突變得到的Klentaq 10和Taq 22突變體枢冤，可以耐受25%的全血和15%的土壤提取物鸠姨，E708殘基可能發(fā)揮了重要作用。相比一般的定向進化手段淹真，CSR技術(shù)為獲得高抑制劑耐受性突變體提供了基礎(chǔ)讶迁。Baar等（Baar, 2011）選擇了與Taq DNa聚合酶序列同源性較高的八個物種的聚合酶為親本，通過StEP技術(shù)獲得8T嵌合體文庫核蘸，以泥炭提取物添瓷、焦油、腐植酸等抑制劑為篩選壓力值纱，經(jīng)過三輪CSR鳞贷，得到了一個優(yōu)秀突變體2D9。2D9是由四種不同的聚合酶混組的嵌合體虐唠，在多種抑制劑存在條件下搀愧，耐受性都有顯著的提高，并且保真度與野生Taq基本一致疆偿。
  （Baar C, 2011）不同抑制劑下2D9對野生型Taq的相對活力
  2014年咱筛，該團隊（Arezi, 2014; Hogrefe, 2016）通過CSR得到一個新的全長Taq突變體Taq 2C2（G59W，V155I杆故，L245M迅箩，L375V，E507K处铛，E734G饲趋，F(xiàn)749I），對EDTA血耐受比例達到65%撤蟆，對肝素血耐受達到25%奕塑，催化速率也比野生酶有所提高，可以作為直接血液核酸檢測試劑盒的聚合酶家肯。2016年龄砰，Schafer等以Taq-E507K為親本，通過定向進化得到一個突變體Taq 15（A61T, K346E, S357C, E507K, I707M, F749I），該突變體對PCR buffer中的緩沖液换棚、鹽離子濃度具有極高的耐受性式镐，可以很好的直接從葡萄、馬鈴薯葉片中擴增>1Kb的DNA片段固蚤，可用于植物葉片直擴PCR試劑盒的研發(fā)碟案。
  
  ⑥快速延伸突變體。Taq DNA聚合酶在72℃時延伸速率大約是60nt/s颇蜡，但實際中一般以1kb/min的速率擴增，一般一個PCR擴增下來辆亏，需要1-2h的時間风秤。對于大樣本量的檢測或者時間要求急迫的檢測，人們希望能夠更快的擴增扮叨。Taq 2C2突變體的催化效率大約是野生Taq的2倍缤弦，氨基酸突變E507K對這種增強作用有重要意義。在一些報道中彻磁，直接提高Taq DNA聚合酶K_cat的突變體不多碍沐，但一般增加了模板親和力或容錯能力的突變體，往往在較短時間內(nèi)擴增長片段的能力也同樣增強衷蜓。
  
  ⑦長片段擴增突變體累提。Taq DNA聚合酶在長片段擴增上，最卓越的成果是Klentaq1與Pfu混合酶（Barnes, 1994; U.S. Patent 5436149）磁浇，可以擴增長達35kb的Lambda DNA片段斋陪，保真性也比Taq DNA聚合酶顯著提高，但單獨的Klentaq1持續(xù)合成能力是顯著下降的（比Taq低10倍）置吓。Ignatov等（US 11/658,610）將Tth DNA polymerase（該酶的擴增能力高于Taq无虚，但區(qū)分對引物3’錯配不敏感）的N端4-600多肽與Taq DNA polymerase的C端554-832多肽拼接成一個新的嵌合體酶Tth-Taq，嵌合體的擴增能力接近Tth衍锚，延伸能力比Taq酶顯著提高友题。將具有DNA結(jié)合能力的ssDNA或dsDNA結(jié)合蛋白與Taq DNA聚合酶融合，也能提高酶的延伸能力戴质，但真正意義上的長延伸突變體度宦，還是Yamagami等（Yamagami, 2014）通過對E742和A743的掃描突變得到的。E742A和A743H兩個突變體能夠很好的從Lambda DNA上擴增15kb的長片段（條件：99℃ 5 s告匠，66℃ 5 min斗埂，30個循環(huán)）。然而有趣的是凫海，E742A/A743H雙突變體的引物延伸能力比單突變強得多呛凶，但PCR效果卻不如單突變體。凝膠遷移實驗的結(jié)果表明雙突變體與DNA產(chǎn)物有更強的結(jié)合能力（在電泳圖上產(chǎn)生拖帶）行贪，這可能不利于PCR起始階段的擴增漾稀，導(dǎo)致PCR失敗模闲。我在融合Sso7d結(jié)構(gòu)域與KOD DNA聚合酶時，也發(fā)現(xiàn)了類似的情況崭捍。有研究人員認(rèn)為尸折，Taq DNA聚合酶校正活性的缺失限制了其長片段擴增能力，因為隨著目標(biāo)產(chǎn)物長度的增加殷蛇，延伸過程出錯配的概率也就越高实夹，阻擋了繼續(xù)延伸，保真酶因為能切除錯配粒梦，往往具有更強的持續(xù)延伸能力亮航。這個解釋符合事實，我認(rèn)為長片段延伸突變體除了提高Taq DNA聚合酶的DNA親和力匀们，也可能增加了“容錯”能力缴淋，實際上是降低了保真性，這類突變體的實際應(yīng)用意義不太大泄朴，高保真聚合酶在這方面明顯具更有優(yōu)勢重抖。
  
  ⑧RNA聚合活性突變體。對Taq DNA聚合酶底物譜的改變祖灰，是其分子改造的一個重要成果之一钟沛，除了前面介紹的增強Taq DNA聚合酶摻入ddNTP、dNTP標(biāo)記物等非標(biāo)準(zhǔn)脫氧核糖核苷酸的突變體局扶，還有些研究將Taq DNA聚合酶變成了Taq RNA聚合酶讹剔。Xia等（Xia, 2002）以Stoffel片段為模板，通過基于噬菌體展示的定向進化详民，將其RNA聚合活性提高10³-10⁴延欠。
  Ong等（Ong J L, 2006）通過一種稱為short-patch CSR的定向進化方法，得到一個突變體AA40（E602V沈跨，A608V由捎，I614M，E615G）能夠以與wt酶摻入dNTPs相同的催化效率摻入NTPs和dNTPs饿凛。
  
  ⑨跨損傷擴增突變體狞玛。Taq DNA聚合酶的跨損傷突變體，大多是由使用CSR技術(shù)而聞名的Holliger實驗室完成的涧窒。d'Abbadie等（d'Abbadie, 2007）以Taq心肪、Tth、Tfl三種聚合酶為親本纠吴，經(jīng)StEP混組和三輪CSR篩選得到若干突變體硬鞍，擴增47,000-60,000年前的洞熊DNA時，成功率比野生酶顯著提高。Loakes等（Loakes, 2009）通過CSR得到一個突變體5D4固该，能過聚合疏水性堿基類似物锅减，后來Millar等（2015）將5D4用于重亞硫酸鹽測序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)5D4能夠很好的跨過DNA損傷伐坏。此外怔匣，Obeid等（Obeid, 2011）以KlenTaq為模板，通過定向進化得到兩個突變體I614K和M747K桦沉，它們獲得了增強的跨損傷擴增能力每瞒。Obeid等I614K和M747K組合在一起后，雙突變體的跨損傷擴增能力修復(fù)能力比單突變體顯著增強纯露。不過剿骨，這些突變體跨損傷能力的增強，是以犧牲保真性或者正常DNA擴增效率為代價的苔埋，它們應(yīng)用范圍比較狹窄，商業(yè)化價值不是太大蜒犯。

• 通過結(jié)構(gòu)域融合得到的突變體
  ⑩結(jié)構(gòu)域融合突變體组橄。一些來源于嗜熱菌的的α-螺旋結(jié)構(gòu)具有穩(wěn)定DNA的作用，Pavlov等（Pavlov, 2002）將DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶V上一段重復(fù)的螺旋-發(fā)夾-螺旋結(jié)構(gòu)融合到Taq DNA聚合酶的N端和C端罚随，結(jié)果N端融合酶TopoTaq對Na⁺玉工、K⁺、甜菜堿的耐受能力顯著提高淘菩，并且耐熱性也有很顯著的增強遵班。Davidson等（Davidson, 2003）將Taq DNA聚合酶的480-485殘基替換為T3 DNA聚合酶的硫氧還蛋白結(jié)合域（TBD），結(jié)果融合體的合成能力提高了20-50倍潮改，移碼突變概率降低6-7倍狭郑。后來，Wang等（Wang, 2004）將來自Sulfolobus solfataricus的Sso7d雙鏈DNA結(jié)合蛋白汇在，融合在Taq和Stoffel片段的N端翰萨，結(jié)果發(fā)現(xiàn)S-Taq與S-Stoffel的持續(xù)合成能力比之前顯著增強，融合蛋白與野生酶的K_cat基本一致糕殉，但K_m比野生酶降低4-8倍亩鬼，融合蛋白還增加了對鹽離子的耐受性，令人興奮的是融合蛋白還沒有改變酶的耐熱性和保真性阿蝶。Sso7d的融合“紅利”在家族B的Pfu DNA聚合酶上效果更明顯雳锋，風(fēng)靡市場的Phusion高保真聚合酶就是Pfu-sso7d。

  （Wang Y, 2004）Taq羡洁，Stoffel和S-Stoffel的PCR效率比較玷过。 以DNA（130 pg / ml）為模板，擴增子的大小顯示在底部。 PCR程序為：95°C 20s冶匹； 94°C 5s习劫，72°C 30s（A）或60s（B）或2min（C），20個循環(huán)嚼隘； 72°C 7分鐘诽里。

結(jié)語

1. CSR在Taq DNA聚合酶定向進化上的應(yīng)用，改變了Taq DNA聚合酶及其他耐熱型DNA聚合酶分子改造的面貌飞蛹。雖然Baar等（2011）認(rèn)為CSR繼承性的選擇聚合酶保真性谤狡，這是其自身的特征，因為這種“自我復(fù)制”必須在“錯誤閾值”內(nèi)進行卧檐。他們應(yīng)該是這個意思：如果CSR篩選到的聚合酶保真性顯著下降墓懂，那么在CSR過程中就會引入隨機突變，而這種隨機突變可能改變原來的性質(zhì)霉囚，比如降低了對篩選的壓力的抗性捕仔，那么CSR就會無法進行下去，即“突變者盈罐，死”榜跌，因此CSR在聚合酶保真性上具有內(nèi)在穩(wěn)定性。但是盅粪，我認(rèn)為這種解釋有一定道理钓葫，但不能保證CSR的保真性，理由有兩個：1. 除非保真性發(fā)生數(shù)量級程度的下降票顾，一般程度的下降础浮，可能對于2.5kb左右的模板，并不會產(chǎn)生大量隨機突變奠骄；2. 即使發(fā)生穩(wěn)定遺傳的隨機突變也可能不會顯著影響針對篩選壓力的性能豆同。當(dāng)然，我們也不能否認(rèn)傳統(tǒng)定向進化方法對Taq DNA聚合酶改造的貢獻含鳞，這種方法需要大量挑選克隆子诱告，然后進行活性分析，是一項十分繁重的工作民晒。相比之下精居，理性設(shè)計或者基于已知位點的突變組合，針對性強的多潜必，它需要以酶和酶-底物復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)為依據(jù)靴姿。對同源性較高的不同DNA聚合酶進行混組，是一種不錯的體變體構(gòu)建方式磁滚，尤其是選取功能互補的親本佛吓。

2. Taq DNA聚合酶具有兩種形式宵晚，全長和N端刪除大片段（統(tǒng)稱Klentaq）。研究認(rèn)為5’-3’外切結(jié)構(gòu)域耐熱型不如聚合結(jié)構(gòu)域维雇，因此Klentaq的熱穩(wěn)定性高于全長酶淤刃，外切結(jié)構(gòu)域具有DNA結(jié)合作用，能阻止聚合酶與模板的徹底解離吱型，因此全長酶具有更強的持續(xù)合成能力逸贾。雖然5’-3’外切結(jié)構(gòu)域在空間上似乎與聚合結(jié)構(gòu)域相互分離，但根據(jù)前文列舉的突變體津滞，不難發(fā)現(xiàn)5’-3’外切結(jié)構(gòu)域?qū)θL酶的底物特異性也有很大影響铝侵，可能5’-3’外切結(jié)構(gòu)域的離去改變了聚合結(jié)構(gòu)域的構(gòu)象。我從PDB數(shù)據(jù)庫下載了全長酶與Klentaq的三維結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)触徐，通過結(jié)構(gòu)擬合發(fā)現(xiàn)咪鲜，全長酶與Klentaq的聚合酶結(jié)構(gòu)域確實存在幾個無法重疊的α螺旋。
   全長Taq與KlenTaq的結(jié)構(gòu)擬合撞鹉。選取全長Taq的三維結(jié)構(gòu)（PDB:1TAQ）和KlenTaq三維結(jié)構(gòu)（PDB:4ELU）疟丙，使用SPDBV執(zhí)行Magic Fit。兩處箭頭代表全長片段與KlenTaq片段不重疊的二級結(jié)構(gòu)鸟雏，有多處不重疊享郊，主要集中在拇指域和手指域，這兩個區(qū)域是已知的底物特異性的關(guān)鍵區(qū)域崔慧，兩者的差異正好說明了兩者在底物特異性上的差異拂蝎。

突變體序列匯總

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[8] Innis M A, Myambo K B, Gelfand D H, et al. DNA sequencing with Thermus aquaticus DNA polymerase and direct sequencing of polymerase chain reaction-amplified DNA[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 1988, 85(24): 9436-9440.
介紹了Taq DNA聚合酶在PCR產(chǎn)物測序中的表現(xiàn)嚷硫。
[9] Clark J M. Novel non-templated nucleotide addition reactions catalyzed by procaryotic and eucaryotic DNA polymerases[J]. Nucleic acids research, 1988, 16(20): 9677-9686.
介紹了一些真核和原核來源（包括Taq DNA聚合酶）的DNA聚合酶检访，在無模板指導(dǎo)情況下，將脫氧核糖核苷酸添加到平端DNA底物的3'羥基末端的特征仔掸。
[10] Lawyer F C, Stoffel S, Saiki R K, et al. Isolation, characterization, and expression in Escherichia coli of the DNA polymerase gene from Thermus aquaticus[J]. Journal of Biological Chemistry, 1989, 264(11): 6427-6437.
介紹了Taq DNA聚合酶的克隆脆贵、大腸桿菌表達及酶學(xué)特征研究。
[11] D'Aquila R T, Bechtel L J, Videler J A, et al. Maximizing sensitivity and specificity of PCR by pre-amplification heating[J]. Nucleic Acids Research, 1991, 19(13): 3749.
介紹了一種提高PCR產(chǎn)量和特異性的方法：將模板與PCR試劑預(yù)先加熱到高于退火溫度的溫度起暮，在熱塊上混合后再進行PCR卖氨。
[12] Holland P M, Abramson R D, Watson R, et al. Detection of specific polymerase chain reaction product by utilizing the 5'-3'exonuclease activity of Thermus aquaticus DNA polymerase[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 1991, 88(16): 7276-7280.
介紹了利用Taq DNA聚合酶5’-3’外切活性切除放射性標(biāo)記探針5’端堿基，通過放射性信號變化檢測DNA的方法负懦，促進了探針法qPCR技術(shù)的發(fā)展筒捺。
[13] Barnes W M. The fidelity of Taq polymerase catalyzing PCR is improved by an N-terminal deletion[J]. Gene, 1992, 112(1): 29-35.
介紹了一個N端236aa缺失的Taq DNA聚合酶突變體KlenTaq，其保真性高于全長酶纸厉。
[14]Huang M M, Arnheim N, Goodman M F. Extension of base mispairs by Taq DNA polymerase: implications for single nucleotide discrimination in PCR[J]. Nucleic acids research, 1992, 20(17): 4567-4573.
介紹了基于Taq DNA聚合酶檢測SNP的原理：如果引物3’末端與模板不匹配系吭，Taq DNA聚合酶擴增效率很低甚至無法擴增靶標(biāo)基因。
[15] Lawyer F C, Stoffel S, Saiki R K, et al. High-level expression, purification, and enzymatic characterization of full-length Thermus aquaticus DNA polymerase and a truncated form deficient in 5'to 3'exonuclease activity[J]. Genome research, 1993, 2(4): 275-287.
介紹了Taq全長和N端刪除片段?289-Taq（Stoffel片段）的克隆表達及酶學(xué)性質(zhì)研究残腌，結(jié)果?289-Taq的熱穩(wěn)定性村斟、鹽離子耐受性高于全長酶贫导，但持續(xù)合成降低10倍。
[16] Hu G. DNA Polymerase-catalyzed addition of nontemplated extra nucleotides to the 3′ of a DNA fragment[J]. DNA and cell biology, 1993, 12(8): 763-770.
介紹8種來源于噬菌體蟆盹、大腸桿菌孩灯、棲熱菌、火球菌等生物的DNA聚合酶逾滥，無模板3'延伸的特點峰档，指出末端延伸的堿基具有一定偏好性，與末端堿基種類有關(guān)寨昙。
[17] Sharkey D J, Scalice E R, Christy K G, et al. Antibodies as thermolabile switches: high temperature triggering for the polymerase chain reaction[J]. Bio/Technology, 1994, 12(5): 506-509.
介紹了幾種高親和力的抗Taq DNA聚合酶單克隆抗體讥巡，37℃時能完全抑制Taq的活性，高溫變性后又能夠完全釋放出Taq的活性舔哪。
[18] Scalice E R, Sharkey D J, Daiss J L. Monoclonal antibodies prepared against the DNA polymerase from Thermus aquaticus are potent inhibitors of enzyme activity[J]. Journal of immunological methods, 1994, 172(2): 147-163.
介紹了九種不同的針對Taq DNA聚合酶重組體的單克隆抗體與Taq的免疫學(xué)作用欢顷。
[19] Barnes W M. PCR amplification of up to 35-kb DNA with high fidelity and high yield from lambda bacteriophage templates[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 1994, 91(6): 2216-2220.
介紹了通過混合Klentaq1與低濃度的Pfu能夠顯著提高PCR延伸長度的現(xiàn)象。
[20] Barnes W M. Thermostable DNA polymerase with enhanced thermostability and enhanced length and efficiency of primer extension: U.S. Patent 5436149[P]. 1995-7-25.
介紹了一個N端缺失突變體Klentaq1與Pfu混合后PCR性能顯著改善的現(xiàn)象捉蚤。
[21] Merkens L S, Bryan S K, Moses R E. Inactivation of the 5′-3′ exonuclease of Thermus aquaticus DNA polymerase[J]. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Gene Structure and Expression, 1995, 1264(2): 243-248.
介紹了兩個Taq DNA聚合酶全長酶突變體抬驴，通過對N端結(jié)構(gòu)域氨基酸的替換，喪失了5'-3'外切活性缆巧，但它們的持續(xù)合成能力接近野生Taq酶布持，顯著高于Klentaq。
[22] Kim Y, Eom S H, Wang J, et al. Crystal structure of Thermus aquaticus DNA polymerase[J]. Nature, 1995, 376(6541): 612.
介紹了Taq DNA聚合酶全長酶的晶體結(jié)構(gòu)陕悬。
[23] Tabor S, Richardson C C. A single residue in DNA polymerases of the Escherichia coli DNA polymerase I family is critical for distinguishing between deoxy-and dideoxyribonucleotides[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 1995, 92(14): 6339-6343.
介紹了一個關(guān)鍵氨基酸的突變题暖，顯著提高了pol I和Taq摻入ddNTP的能力，這個堿基是pol I:F762捉超、Taq:F667胧卤，對應(yīng)位置T7 DNA聚合酶上的Y526。
[24] Reeve, M. A., & Fuller, C. W. A novel thermostable polymerase for DNA sequencing. Nature, 1995, 376(6543): 796–797.
介紹了F667Y突變顯著提高了Taq DNA聚合酶（KF）的ddNTP摻入活性狂秦。
[25] Eom S H, Wang J, Steitz T A. Structure of Taq polymerase with DNA at the polymerase active site[J]. Nature, 1996, 382(6588): 278-281.
介紹了Taq DNA聚合酶與引物-模板復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)灌侣，比較了Taq KF與pol I KF的結(jié)構(gòu)差異推捐。
[26] Magnuson V L, Ally D S, Nylund S J, et al. Substrate nucleotide-determined non-templated addition of adenine by Taq DNA polymerase: implications for PCR-based genotyping and cloning[J]. BioTechniques, 1996, 21(4): 700-709.
介紹了Taq DNA聚合酶無模板3'延伸的概率與反向引物5’端堿基的種類有關(guān)裂问，還與PCR程序有關(guān)。研究指出牛柒，在使用Taq DNA聚合酶進行等位基因分型和TA克隆時堪簿，根據(jù)3'端延伸特征調(diào)整引物設(shè)計是有利的。
[27] Cline J, Braman J C, Hogrefe H H. PCR fidelity of pfu DNA polymerase and other thermostable DNA polymerases[J]. Nucleic acids research, 1996, 24(18): 3546-3551.
介紹了Taq皮壁、Pfu椭更、Vent等一些耐熱型DNA聚合酶的保真性。
[28] Vander Horn P B, Davis M C, Cunniff J J, et al. Thermo Sequenase? DNA polymerase and T. acidophilum pyrophosphatase: new thermostable enzymes for DNA sequencing[J]. BioTechniques, 1997, 22(4): 758-765.
介紹了嗜酸嗜熱菌無機焦磷酸酶（TAP）與Klentaq(F667Y)配合蛾魄，可以產(chǎn)生均勻條帶強度的序列數(shù)據(jù)虑瀑，從而可以進行更長湿滓、更準(zhǔn)確的序列測定。
[29] Li Y, Korolev S, Waksman G. Crystal structures of open and closed forms of binary and ternary complexes of the large fragment of Thermus aquaticus DNA polymerase I: structural basis for nucleotide incorporation[J]. The EMBO journal, 1998, 17(24): 7514-7525.
介紹了Klentaq1-DNA模板-ddNTP三元復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)舌狗。
[30] Li Y, Mitaxov V, Waksman G. Structure-based design of Taq DNA polymerases with improved properties of dideoxynucleotide incorporation[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 1999, 96(17): 9491-9496.
介紹了一個Klentaq1突變體R660D/F667Y叽奥，該突變體即顯著增強了摻入ddNTP的活性，又增加了摻入ddNTP的均一性痛侍。
[31] Ghadessy F J, Ong J L, Holliger P. Directed evolution of polymerase function by compartmentalized self-replication[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2001, 98(8): 4552-4557.
介紹了CSR技術(shù)在DNA聚合酶定向進化中的應(yīng)用朝氓，作者通過CSR篩選得到兩個Taq DNA聚合酶突變體T8（熱穩(wěn)性明顯提高）和H15（肝素耐受性提高130倍以上）。CSR技術(shù)改變了熱穩(wěn)定DNA聚合酶的定向進化方式主届，意義重大赵哲。
[32] Ahmadian A, Gharizadeh B, O’Meara D, et al. Genotyping by apyrase-mediated allele-specific extension[J]. Nucleic acids research, 2001, 29(24): e121-e121.
介紹了通過腺苷三磷酸酶提高等位基因特異性延伸準(zhǔn)確性的方法，3'端匹配時DNA合成速率快君丁，可以正常摻入核苷酸枫夺，3'端錯配時DNA合成緩慢，來不及延伸即被腺苷三磷酸酶降解绘闷。
[33] Pavlov A R, Belova G I, Kozyavkin S A, et al. Helix–hairpin–helix motifs confer salt resistance and processivity on chimeric DNA polymerases[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2002, 99(21): 13510-13515.
介紹了HhH模體與Taq DNA聚合酶形成融合蛋白的性質(zhì)筷屡，提高了熱穩(wěn)定性和鹽離子耐受性。
[34]Xia G, Chen L, Sera T, et al. Directed evolution of novel polymerase activities: mutation of a DNA polymerase into an efficient RNA polymerase[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2002, 99(10): 6597-6602.
介紹了一個RNA聚合活性顯著增強的Taq DNA聚合酶的突變體簸喂。
[35] Davidson J F, Fox R, Harris D D, et al. Insertion of the T3 DNA polymerase thioredoxin binding domain enhances the processivity and fidelity of Taq DNA polymerase[J]. Nucleic acids research, 2003, 31(16): 4702-4709.
介紹了一個將來源于T3 DNA聚合酶的硫氧還蛋白結(jié)合域插入Taq DNA聚合酶3’-5’外切結(jié)構(gòu)域的突變體毙死，顯著提高了Taq酶的延伸能力并將降低了對DNA重復(fù)單元的移碼突變率。
[36] Wang Y, Prosen D E, Mei L, et al. A novel strategy to engineer DNA polymerases for enhanced processivity and improved performance in vitro[J]. Nucleic acids research, 2004, 32(3): 1197-1207.
介紹了將一個雙鏈DNA結(jié)合蛋白(sso7d)與DNA聚合酶融合后喻鳄，顯著改善酶延伸能力的現(xiàn)象扼倘。本文分別將sso7d融合在Taq DNA聚合酶(?289)和Pfu DNA聚合酶的N端和C端，不但顯著增強了酶的持續(xù)合成能力除呵，還不影響聚合酶的保真性等催化性能再菊。Pfu-S7后來被廣泛應(yīng)用于高保真PCR，它就是現(xiàn)在大名鼎鼎的Phusion DNA聚合酶颜曾。
[37] Kermekchiev M B, Tzekov A, Barnes W M. Cold-sensitive mutants of Taq DNA polymerase provide a hot start for PCR[J]. Nucleic acids research, 2003, 31(21): 6139-6147.
介紹了一個Klentaq的冷敏感突變體Cs3AC纠拔，該突變體低溫（37℃）時幾乎沒有聚合活性，高溫（68℃）時保持正常聚合活性泛豪，可以實現(xiàn)DNA的熱啟動可擴增稠诲。
[38] Germer S, Higuchi R. Homogeneous allele-specific PCR in SNP genotyping[M]//Single Nucleotide Polymorphisms. Springer, Totowa, NJ, 2003: 197-214.
介紹了SNP檢測的實時監(jiān)測改進：將位點特異性PCR與（SYBR green I）qPCR結(jié)合。
[39] Sauter, K. B. M., Marx, A., Evolving thermostable reverse transcriptase activity in a DNA polymerase scaffold. Angew. Chem. Int. Ed. 2006, 45, 7633–7635.
介紹了一個具有RNA聚合酶活性的Klentaq突變體M1诡曙，可用于一步法RT-qPCR檢測臀叙。
[40] Ong J L, Loakes D, Jaroslawski S, et al. Directed evolution of DNA polymerase, RNA polymerase and reverse transcriptase activity in a single polypeptide[J]. Journal of molecular biology, 2006, 361(3): 537-550.
介紹了一個改變了底物譜的Taq DNA聚合酶突變體，該突變體能夠以基本相同的催化效率摻入dNTP個NTP价卤，是一個耐熱DNA/RNA合成雙活性聚合酶劝萤。
[41] Gloeckner C, Sauter K B M, Marx A. Evolving a thermostable DNA polymerase that amplifies from highly damaged templates[J]. Angewandte Chemie International Edition, 2007, 46(17): 3115-3117.
介紹了一個KlenTaq突變體M747K，M747K增加了dNTP錯誤摻入和錯配延伸的可能性慎璧。
[42] d'Abbadie M, Hofreiter M, Vaisman A, et al. Molecular breeding of polymerases for amplification of ancient DNA[J]. Nature biotechnology, 2007, 25(8): 939-943.
介紹了一個能繞過DNA損傷和引物3’錯配錯配的一組突變體床嫌，并將突變體混合酶用于古代DNA的擴增跨释，成功率顯著提高。
[43] Loakes D, Gallego J, Pinheiro V B, et al. Evolving a polymerase for hydrophobic base analogues[J]. Journal of the American Chemical Society, 2009, 131(41): 14827-14837.
介紹了一個能夠摻入疏水性堿基類似物的突變體5D4厌处，通過CSR改變了Taq DNA聚合酶的底物譜煤傍。
[44] Kermekchiev M B, Kirilova L I, Vail E E, et al. Mutants of Taq DNA polymerase resistant to PCR inhibitors allow DNA amplification from whole blood and crude soil samples[J]. Nucleic acids research, 2009, 37(5): e40-e40.
介紹了一個新的熱啟動Taq DNA聚合酶突變體Klentaq 10，除保持了冷敏感的特征外嘱蛋，還顯著提高了熒光染料等抑制劑抗性蚯姆，可用于熱啟動qPCR擴增。
[45] Gaudet M, Fara A G, Beritognolo I, et al. Allele-specific PCR in SNP genotyping[M]//Single Nucleotide Polymorphisms. Humana Press, Totowa, NJ, 2009: 415-424.
介紹了SNP檢測中基于多位點擴增的單管反應(yīng)法：使用兩條上游引物（分別對應(yīng)兩種基因型）和一條下游引物，其中一條上游引物5’端加一段“尾巴”，并在等位基因第-1位設(shè)置一個額外的錯配短蜕，這樣3’末端不匹配的引物幾乎完全不延伸，最后根據(jù)電泳條帶的數(shù)目與位置即可準(zhǔn)確判定基因型郭毕。
[46] Ignatov K, Kramarov V, Billingham S. Chimeric DNA polymerase: U.S. Patent Application 11/658,610[P]. 2009-8-20.
介紹了一個Tth DNA polymerase與Taq DNA polymerase的嵌合體酶，嵌合體集合了Tth與Taq的雙重優(yōu)勢函荣，延伸能力顯著增強显押。這種嵌合體的方式也是酶分子改造的一種重要手段，不過它有一個前提傻挂，嵌合的親本之間必須有較高的序列同源性乘碑。
[47] Guo J, Yu L, Turro N J, et al. An integrated system for DNA sequencing by synthesis using novel nucleotide analogues[J]. Accounts of chemical research, 2010, 43(4): 551-563.
介紹了基于3'端核苷酸可逆終止子（NRT）和可裂解的熒光雙脫氧核苷酸（ddNTP）的DNA合成測序（SBS）用于第二代DNA測序的原理及潛力，為NGS高通量測序系統(tǒng)開發(fā)提供了參考金拒。
[48] Leconte A M, Patel M P, Sass L E, et al. Directed Evolution of DNA Polymerases for Next-Generation Sequencing[J]. Angewandte Chemie International Edition, 2010, 49(34): 5921-5924.
介紹了一個Taq DNA聚合酶突變體Taq197兽肤，顯著增加了可逆性修飾dNTP的摻入活性，具有NGS測序酶應(yīng)用潛力绪抛。
[49] Chen F, Gaucher E A, Leal N A, et al. Reconstructed evolutionary adaptive paths give polymerases accepting reversible terminators for sequencing and SNP detection[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2010, 107(5): 1948-1953.
介紹了兩個Taq DNA聚合酶突變體资铡，摻入dNTP-ONH2底物的活性顯著增強，還能同時摻入ddNTP幢码，其中L616A對底物譜變化具有重要影響笤休。
[50] Kranaster R, Drum M, Engel N, et al. One-step RNA pathogen detection with reverse transcriptase activity of a mutated thermostable Thermus aquaticus DNA polymerase[J]. Biotechnology journal, 2010, 5(2): 224-231.
介紹了一個Taq DNA聚合酶突變體Taq M1，它具有與野生型酶相似的PCR敏感性和5’-3’核酸酶活性症副，同時也表現(xiàn)出逆轉(zhuǎn)錄酶的能力店雅，可用于一步法RT-qPCR檢測。
[51] Baar C, d’Abbadie M, Vaisman A, et al. Molecular breeding of polymerases for resistance to environmental inhibitors[J]. Nucleic acids research, 2011, 39(8): e51-e51.
介紹了一個通過CSR技術(shù)得到的抑制劑抗性Taq DNA聚合酶突變體2D9瓦糕，將同源性較高的8種不同的聚合酶進行混組底洗，通過CSR篩選得到2D9突變體腋么，對腐植酸咕娄、土壤提取物、焦油等抑制劑均有較強的耐受性珊擂，可用于直擴PCR圣勒。
[52] Obeid S, Schnur A, Gloeckner C, et al. Learning from directed evolution: Thermus aquaticus DNA polymerase mutants with translesion synthesis activity[J]. ChemBioChem, 2011, 12(10): 1574-1580.
介紹了一個KlenTaq組合突變體费变，用于損傷性DNA檢測的性能。作者將通過定向進化得到兩個突變體I614K和M747K組合到一起圣贸，結(jié)果雙重突變體在擴增有損傷的DNA時挚歧，擴增能力比單突變體顯著提高。
[53] Blatter N, Bergen K, Nolte O, et al. Structure and Function of an RNA‐Reading Thermostable DNA Polymerase[J]. Angewandte Chemie International Edition, 2013, 52(45): 11935-11939.
介紹了一個Taq DNA聚合酶突變體RT-KTq2吁峻，它是在Taq M1基礎(chǔ)上進一步突變得到的滑负，逆轉(zhuǎn)錄活性更高，qPCR靈敏性更高用含，在RNA病毒一步RT-qPCR檢測中具有不錯的效果矮慕。
[54] Chen C Y. DNA polymerases drive DNA sequencing-by-synthesis technologies: both past and present[J]. Frontiers in microbiology, 2014, 5: 305.
介紹了聚合酶的改造及發(fā)展對NGS技術(shù)的推動。
[55] Arezi B, McKinney N, Hansen C, et al. Compartmentalized self-replication under fast PCR cycling conditions yields Taq DNA polymerase mutants with increased DNA-binding affinity and blood resistance[J]. Frontiers in microbiology, 2014, 5: 408.
介紹了幾個對全血耐受性極強的突變體啄骇，它們的催化速率比野生酶有所提高痴鳄，表觀解離常數(shù)降低35-90倍。研究還發(fā)現(xiàn)E507K能顯著提高Taq在95℃下的半衰期
[56] Yamagami T, Ishino S, Kawarabayasi Y, et al. Mutant Taq DNA polymerases with improved elongation ability as a useful reagent for genetic engineering[J]. Frontiers in microbiology, 2014, 5: 461.
介紹了通過對兩個氨基酸的替換能夠顯著提高Taq DNA聚合酶PCR延伸長度的研究缸夹。
[57] Millar D, Christova Y, Holliger P. A polymerase engineered for bisulfite sequencing[J]. Nucleic acids research, 2015, 43(22): e155-e155.
介紹了一個Taq DNA聚合酶突變體5D4痪寻，5D4是一種Taq DNA聚合酶和Tth DNA聚合酶的嵌合體，能夠繞過重亞硫酸鹽處理DNA的dU堿基和未轉(zhuǎn)化完全的中間體dhU6S虽惭，研究人員使用5D4/Taq混合酶擴增BS處理后的人基因DNA片段橡类，擴增效果顯著優(yōu)于Taq DNA聚合酶。雖然5D4/Taq的保真性比野生Taq有所下降芽唇，但在測序深度的修正下猫态，不影基因甲基化位點分析的準(zhǔn)確性。
[58] Schafer W, McEwan P, Van Der Walt E, et al. Modified DNA polymerases for improved amplification: U.S. Patent 9,315,787[P]. 2016-4-19.
介紹了一個Taq DNA聚合酶突變體Taq 15披摄，對高濃度緩沖液和鹽離子的耐受性顯著增強亲雪，用于植物葉片的直接擴增表現(xiàn)良好。
[59] Hogrefe H, Cayouette M, Fox J, et al. Thermostable type-A DNA polymerase mutants with increased polymerization rate and resistance to inhibitors: U.S. Patent 9,523,085[P]. 2016-12-20.
介紹了Taq 2C2突變體應(yīng)用在qPCR中疚膊，在縮短延伸時間和全血抑制抗性方面的表現(xiàn)义辕。
[60] Bourn W, Appel M, Rush G, et al. Modified type A DNA polymerases: U.S. Patent 10,457,968[P]. 2019-10-29.
KAPA公司的專利，介紹一些定向進化得到的Taq DNA聚合酶突變體寓盗，文中列舉的突變體比較多灌砖，其中Taq D2在DNA結(jié)合能力、高鹽離子（K+傀蚌、Na+）濃度抗性基显、PCR延伸長度、苯酚抗性方面比野生Taq具有更好的表現(xiàn)善炫。