摘要

背景

Wilson病（WD）是由編碼銅轉(zhuǎn)運蛋白的ATP7B突變引起的常染色體隱性遺傳疾病蚊伞。隨后的銅積累導致涉及肝叫编，神經(jīng)和精神癥狀的可變WD臨床表型杯活，沒有明確的基因型 - 表型相關(guān)性虱歪。本研究的目的是分析來自WD患者的肝臟和血液中全基因組水平的DNA甲基化改變蜂绎，以研究與WD診斷和表型相關(guān)的表觀基因組改變。我們使用全基因組亞硫酸氫鹽測序（WGBS）來檢查WD受試者的不同群組实蔽，以確定DNA甲基化是否可以區(qū)分患者與健康受試者和患有其他肝臟疾病的受試者并區(qū)分不同的WD表型。

結(jié)果

肝臟中的WGBS分析鑒定了969個高甲基化區(qū)域和871個低甲基化差異甲基化區(qū)域（DMR）谨读，特異性識別WD患者局装，包括具有全基因組顯著性的18個區(qū)域。WD特異性肝臟DMR與富含葉酸和脂質(zhì)代謝功能以及急性炎癥反應的基因相關(guān)劳殖，并且可以區(qū)分WD患者的早期纖維化铐尚。功能注釋顯示W(wǎng)D-高甲基化肝臟DMR富含肝臟特異性增強子，側(cè)翼活性肝臟啟動子和肝臟發(fā)育轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點哆姻，包括肝細胞核因子4α（HNF4A）宣增，維甲酸X受體α（RXRA），F(xiàn)orkhead方框A1（FOXA1）和FOXA2矛缨。還鑒定了與WD發(fā)育相關(guān)的DMR爹脾，包括具有全基因組顯著性的15個帖旨。然而，肝臟中的WD DMR與肝細胞類型比例的大規(guī)模變化無關(guān)灵妨。在血液分化的WD患者中檢測到來自健康和疾病對照受試者的DMR解阅，并區(qū)分具有肝和神經(jīng)性WD表現(xiàn)的患者。WD表型DMR對應于富含精神衰退泌霍，異常B細胞生理學功能的基因货抄，以及作為多梳抑制復合物1（PRC1）的成員。在小驗證隊列中測試的與WD表型相關(guān)的44個DMR具有0.9的預測值朱转。

結(jié)論

我們確定了WD的疾病機制相關(guān)的表觀基因組特征蟹地，揭示了對這種復雜的單基因疾病的潛在生物標志物和治療方法的新見解。

電子輔助材料

關(guān)鍵詞：Wilson病藤为，表觀遺傳學怪与，銅，DNA甲基化凉蜂，全基因組亞硫酸氫鹽測序琼梆，染色質(zhì)，肝臟窿吩，血液茎杂，生物標志物，增強子

背景

Wilson踩已恪（WD）是一種常染色體隱性疾病煌往，由銅的積聚主要在肝臟和大腦中引起，這是由于突變影響銅轉(zhuǎn)運基因轧邪，ATPase銅轉(zhuǎn)運β（ATP7B）刽脖。在健康個體中，ATP7B有助于銅販賣肝細胞內(nèi)和所需的銅排泄到膽道[ 1忌愚，2 ]曲管。然而，雖然現(xiàn)在更好地理解遺傳基礎(chǔ)硕糊，但由于對深層致病機制的不完全理解院水，缺乏金標準診斷測試以及最終有限的治療選擇，WD仍然代表臨床上具有挑戰(zhàn)性且往往未被認識的病癥 [3]]简十。臨床表現(xiàn)包括肝臟檬某，神經(jīng)和精神病表現(xiàn)。DNA序列突變與臨床表現(xiàn)之間缺乏明確的相關(guān)性可歸因于超過500種突變的存在螟蝙，這些突變共同損害ATP7B銅轉(zhuǎn)運蛋白活性恢恼，并且可能存在伴隨的修飾基因。最引人注目的證據(jù)表明胰默，遺傳突變因素不談影響表型從描述受WD單卵雙生子但呈現(xiàn)不同的表型[多個病例報告衍生4场斑，5 ]漓踢。

DNA甲基化是一種可逆的表觀遺傳修飾，受遺傳和非遺傳因素如營養(yǎng)和毒素暴露的影響和簸，并作用于遺傳和環(huán)境之間的界面彭雾。營養(yǎng)因素影響甲硫氨酸代謝和甲基對DNA和組蛋白甲基化的全球可用性。的WD變化顯示甲硫氨酸代謝[動物模型6锁保，7 ]和基因轉(zhuǎn)錄物水平響應于膳食規(guī)定甲基供體[的8]薯酝。特別是，已知銅會干擾S-腺苷同型半胱氨酸水解酶（SAHH）的表達和活性爽柒，而后者又會影響S-adenosylhomocysteine（SAH）水平和DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性和表達[ 9 ]吴菠。

通過轉(zhuǎn)錄因子介導的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶和去甲基化酶的募集，可以在個別基因座處改變DNA甲基化浩村，從而影響未來的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合效率[ 10 ]做葵。基因啟動子的甲基化與基因表達呈負相關(guān)心墅，而基因體甲基化則呈正相關(guān)酿矢。在患有常見肝病的患者中，已經(jīng)在血液和肝臟中觀察到基因特異性DNA甲基化模式的變化怎燥，并且已經(jīng)與肝病嚴重程度的不同階段相關(guān)[ 11 ]瘫筐。雖然肝臟和大腦是WD中受影響最大的組織，但血漿中的銅也會增加[ 12]铐姚。增加的體液免疫應答策肝，降低的細胞介導的免疫應答，并在伽馬Δ+ T細胞的增加已經(jīng)在WD患者的血液中發(fā)現(xiàn)隐绵，這表明肝臟和血液可以具有特性甲基化的簽名在WD [ 13之众，14 ] 。

有強有力的證據(jù)支持動物模型中WD發(fā)病機制中甲硫氨酸代謝的改變依许，以及間接證據(jù)支持相同機制在人類發(fā)病和進展中的作用[ 15 ]棺禾。在本研究中，我們探討了這樣的假設(shè)：肝臟和血液中的DNA甲基化模式可以區(qū)分健康受試者和受其他肝臟疾病影響的受試者（包括非酒精性脂肪性肝睬吞（NAFLD））的各種表型表現(xiàn)的WD患者膘婶。 ）和原發(fā)性硬化性膽管炎（PSC），最終目標是確定對致病機制坦康，診斷標志物和治療目標的新見解竣付。

結(jié)果

肝臟樣本的臨床特征

共有21個肝臟樣本可用于甲基化組分析诡延，其中6個來自正常肝臟組織學的減肥手術(shù)的健康對照（HC）滞欠，5個來自NAFLD（疾病對照，DC）的受試者肆良，10個來自WD患者筛璧，包括來自肝硬化和急性肝衰竭患者的5例經(jīng)皮肝活組織檢查和5例來自外植肝臟的活檢（附加文件1：表S1逸绎，附加文件2：表S2）。所有受試者的中位年齡為44歲（范圍22-72夭谤，三組之間沒有差異）棺牧。與WD患者相比，HC具有更高的BMI朗儒，因為樣本來自減肥手術(shù)患者颊乘。正如預期的那樣，與其他受試者相比醉锄，WD患者呈現(xiàn)出顯著更晚期的纖維化階段乏悄。

肝臟中的DMR將WD患者與健康和疾病對照區(qū)分開來

為了鑒定肝臟中WD特異性的DNA甲基化變化，來自WD（n? = 10）恳不，HC（n? = 6）和DC（n? = 5）受試者的樣品通過WGBS分析每組之間的DMR檩小。鑒定了969個高甲基化區(qū)域和871個低甲基化區(qū)域，其特異性地區(qū)分WD與HC和DC受試者烟勋，但不是來自HC受試者的DC（圖 1a）规求。在這些WD特異性DMR中，18個通過FWER達到全基因組顯著性（表 1）卵惦。這18個DMR附近的基因包括那些在肝臟發(fā)育中具有已知功能的基因（BST1阻肿，FOXA1和VTN）和轉(zhuǎn)錄調(diào)控（FOXA1，MAFB鸵荠，MN1冕茅，NACC2，ZNF689和ZNF785）蛹找。WD特異性肝臟DMR的基因本體分析顯示姨伤，高甲基化DMR附近的基因富含與急性炎癥反應，脂質(zhì)分解代謝和葉酸代謝相關(guān)的功能（附加文件1：圖S1）庸疾。相反乍楚，低甲基化DMR附近的基因富含與體液免疫應答，脂肪酸轉(zhuǎn)運和糖酵解調(diào)節(jié)相關(guān)的功能届慈。

圖1

)

圖徒溪。1

肝臟DMR區(qū)分WD患者與對照組。鑒定了 WGBS衍生的DMR金顿，其區(qū)分WD與HC和DC臊泌，但不區(qū)分來自HC的DC（WD n? = 10，HC n? = 6揍拆，DC n? = 5）矗钟。高甲基化的DMR在WD中具有較高的甲基化锰提，而低甲基化的DMR在WD中具有較低的甲基化豆赏。b使用WD特異性肝臟DMR中甲基化的HC，WD和DC熱圖贮喧。繪制每個樣品相對于每個DMR的平均甲基化的甲基化百分比。C在WD特異性肝臟DMR中使用甲基化的主成分分析猪狈。每個點的大小表示患者的纖維化階段箱沦。省略號顯示95％的置信區(qū)間。對于這個和所有后續(xù)數(shù)字：DMR雇庙，差異甲基化區(qū)域; WD谓形，Wilson病; WGBS，全基因組亞硫酸氫鹽測序; HC疆前，健康控制; DC套耕，疾病控制

表格1

WD特異性肝臟DMR具有全基因組顯著性和相關(guān)基因

FWER碾牌，家庭智能錯誤率

大多數(shù)WD受試者可從HC和DC受試者中清楚地區(qū)分甲基化水平的WD-肝特異性的DMR內(nèi)的基礎(chǔ)上（圖 1 B康愤，C）。這些DMR中的甲基化與性別舶吗，年齡征冷，BMI，炎癥或脂肪變性無關(guān)（附加文件1：圖S2誓琼，附加文件2：表S3）检激。相反，在WD特定的DMRS整體腹侣，由第一主成分表示的甲基化叔收，用纖維化（相關(guān)聯(lián)的p ?= 2.5E-4），其也可以在WD的樣品（圖中觀察到的異質(zhì)性 1個 C）傲隶。單獨地饺律，23個DMR（1％的WD特異性DMR）與纖維化相關(guān)（Bonferroni調(diào)整后p ?<0.05，附加文件2）：表S3）跺株。此外复濒，63例（3％）WD特異性DMR與先前在NAFLD受試者的纖維化甲基化研究中發(fā)現(xiàn)的DMR重疊[ 16 ]。然而乒省，大多數(shù)個體WD特異性DMR與纖維化無顯著相關(guān)性巧颈。

為了研究纖維化發(fā)病前肝臟中WD特異性DNA甲基化的變化，將早期（0-1期）WD患者（n? = 3）與HC（n? = 6）和早期DC（n? = 4）科目袖扛。鑒定了124個高甲基化區(qū)域和70個低甲基化區(qū)域砸泛，區(qū)分早期WD患者，其與人口統(tǒng)計學協(xié)變量無關(guān)（附加文件1：圖S3，附加文件2：表S4）晾嘶。其中76個早期區(qū)域和167個相關(guān)基因與從所有WD患者中鑒定的WD特異性肝臟DMR重疊，顯著富集（Hyper：p ?= 5.2E-82娶吞，Hypo：p?= 1.4E-31）垒迂。此外，在WD的tx-j小鼠模型中妒蛇，基于人WD差異甲基化選擇的10個基因與病理早期的肝臟中的對照相比顯著差異表達（q ?<0.05机断，附加文件1：表S5）。這些基因的GATA6绣夺，HDAC5吏奸，Pmpca，Pnpla7和Tspan9上調(diào)陶耍，而FOXA1奋蔚，MAFB，Nacc2烈钞，PCX和的Vtn被下調(diào)了泊碑。這些結(jié)果一起表明，在人WD肝臟中檢測到的甲基化差異具有功能性后果毯欣，并且與早期發(fā)病機制相關(guān)馒过，而不是晚期纖維化的結(jié)果。

WD特異性高甲基化肝臟DMR富含肝臟增強劑和側(cè)翼活性肝臟啟動子

為了對從所有樣本中鑒定的WD特異性肝臟DMR進行功能性注釋酗钞，將Roadmap Epigenomics Project [ 17 ]中127種細胞和組織類型的組蛋白修飾ChIP-seq峰和染色質(zhì)狀態(tài)預測與DMR染色體位點進行比較（圖 2））腹忽。高甲基化WD特異性DMR高度顯著富集肝臟H3K4me1和H3K4me3組蛋白修飾標記分別重疊87％和50％的高甲基化DMR（H3K4me1優(yōu)勢比= 28.6，錯誤發(fā)現(xiàn)率（FDR）q ?<1.0E-319; H3K4me3賠率比率= 8.8砚作，F(xiàn)DR q?= 7.6E-210）窘奏。相反，低甲基化的WD特異性DMR在許多組織類型中富含H3K4me1和H3K4me3標記葫录。接下來蔼夜，WD特異性肝臟DMR與ChromHMM染色質(zhì)狀態(tài)預測重疊，后者使用組蛋白修飾ChIP-seq數(shù)據(jù)將基因組分成15個功能狀態(tài)压昼。相比在所有的組織背景中增強子（ENH求冷，黃色）和區(qū)域側(cè)翼活性轉(zhuǎn)錄起始位點（TssAFlnk，橙色）組合WD特定的DMRS顯示顯著富集（圖 2 b）中窍霞，與這些功能區(qū)的一個顯著顯著富集（圖 2 C）匠题。高甲基化WD特異性DMR也分別在肝臟增強子和活性轉(zhuǎn)錄起始位點側(cè)翼區(qū)域特異性富集（附加文件1）：圖S4; Enh比值比= 11.6，F(xiàn)DR q ?= 5.5E-278; TssAFlnk比值比= 10.1但金，F(xiàn)DR q ?= 3.7E-192）韭山。轉(zhuǎn)錄區(qū)側(cè)翼區(qū)域也顯著富集，但僅構(gòu)成一小部分高甲基化DMR。

圖2

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WD特異性高甲基化肝臟DMR富含肝臟增強劑和側(cè)翼活性肝臟啟動子钱磅。使用LOLA 將 WD肝臟DMR與來自表觀基因組路線圖的組蛋白修飾ChIP-seq峰重疊梦裂，并對所有組織繪制比值比。b盖淡，c WD肝臟DMR與使用LOLA的表觀基因組路線圖中的染色質(zhì)狀態(tài)重疊年柠，并且將每個狀態(tài)重疊的DMR和背景區(qū)域的百分比繪制為b所有組織的平均重疊或肝臟的c重疊

肝臟中WD特異性高甲基化DMR富含肝相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點

為了確定WD特異性肝臟DMR的甲基化差異與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的潛在關(guān)聯(lián)，DMR與來自ENCODE的肝臟中的轉(zhuǎn)錄因子ChIP-seq峰重疊（圖 3a）并評估已知轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點序列的富集褪迟∪吆蓿基序（圖 3 b）中。高甲基化的DMR富含HNF4A味赃，RXRA掀抹，F(xiàn)OXA1和FOXA2的肝結(jié)合位點和序列基序，而低甲基化的DMR沒有富集這些因子（附加文件1：圖S5）心俗。當高甲基化DMR與HNF4A傲武，RXRA，F(xiàn)OXA1和FOXA2的重疊結(jié)合位點重疊時城榛，它們富集重疊相同的DMR谱轨，包括82個含有所有這四種因子的區(qū)域（圖 3）c，d）吠谢。一種這樣的DMR是在LRRC3土童，用全基因組顯著性在WD肝特異性甲基化，并含有重疊為這些因素所有四個（圖肝結(jié)合位點 3 E）工坊。

圖3

WD特異性高甲基化肝臟DMR富含肝臟相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點献汗。一個 WD肝臟的DMR使用LOLA可用肝轉(zhuǎn)錄因子芯片起峰重疊從ENCODE和比值比作圖并通過高甲基化DMR比值比來分類的。b使用HOMER測試WD肝臟DMR序列的富集的已知轉(zhuǎn)錄因子基序王污，并繪制具有肝臟ChIP-seq數(shù)據(jù)的因子罢吃。c與頂部肝臟轉(zhuǎn)錄因子ChIP-seq峰重疊的高甲基化WD肝臟DMR重疊。d轉(zhuǎn)錄因子重疊富集昭齐。e重組轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點和高甲基化DMR的UCSC基因組瀏覽器視圖LRRC3

WD進展相關(guān)的肝臟DMR顯示補體激活和胚胎發(fā)育途徑的失調(diào)與疾病嚴重性的增加

為了確定與WD進展相關(guān)的肝臟DNA甲基化變化尿招，早期（0-1階段）和晚期纖維化階段（≥2）WD患者進行了比較并評估了DMR（早期WD n? = 3，晚期WD n? = 7） 阱驾。1339米高甲基化和低甲基化1119的區(qū)域被確定為與疾病進展變化的就谜，受試者可以通過級甲基化這些的DMR的基礎(chǔ)上進行分離（圖 4的a，b）里覆。然而丧荐，甲基化與協(xié)變量無關(guān)（附加文件2：表S6）。在這些WD進展DMR中喧枷，15個達到全基因組顯著性（附加文件1：表S7）虹统。這些重要DMR附近的基因包括參與血液凝固的基因（F7弓坞，F10），免疫激活（RNF123车荔，SIGLEC15）和線粒體功能（KAT2A渡冻，LIAS和SARDH）。所有WD進展DMR的功能富集分析顯示忧便，高甲基化區(qū)域富集參與補體激活族吻，體液免疫應答和脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)的基因，而低甲基化區(qū)域富集參與心臟茬腿，呼吸，肌肉和內(nèi)胚層發(fā)育的基因（圖2）宜雀。 4 c）切平。這些數(shù)據(jù)表明在WD進展期間發(fā)生與補體激活和胚胎發(fā)育相關(guān)的基因的DNA甲基化改變。

圖4

肝臟DMRs區(qū)分早期和晚期WD患者辐董。WD進展相關(guān)的肝臟DMR富集參與補體激活和胚胎發(fā)育的基因悴品。高甲基化的DMR在晚期WD中具有較高的甲基化，而低甲基化的DMR在晚期WD中具有較低的甲基化（早期WD n? = 3简烘，晚期WD n? = 7）苔严。在早期與晚期WD肝臟DMR中使用甲基化的熱圖。繪制每個樣品相對于每個DMR的平均甲基化的甲基化百分比孤澎。b在早期與晚期WD肝臟DMR中使用甲基化的主成分分析届氢。省略號顯示95％的置信區(qū)間。C與背景相比覆旭，早期與晚期WD肝臟DMR的GREAT功能富集分析的結(jié)果退子。顯示了來自FDR q ?<0.05的高甲基化或低甲基化DMR的基因本體數(shù)據(jù)庫的前10個術(shù)語（虛線表示顯著性閾值）。對于這個以及隨后的所有數(shù)據(jù)：FDR; 錯誤的發(fā)現(xiàn)率

WD相關(guān)的肝臟DMR基因富含藥物靶標

鑒定與WD診斷和嚴重程度相關(guān)的肝臟中具有差異甲基化的基因提供了預測可能與這些基因相互作用并可能改變WD病理學的治療劑的機會型将。為了鑒定與WD DMR相關(guān)的藥物寂祥，已知藥物 - 基因相互作用從藥物基因相互作用數(shù)據(jù)庫[ 18 ]獲得并與WD DMR基因重疊（附加文件2：表S8）。最顯著富集的藥物是bepridil七兜，它是一種鈣拮抗劑丸凭，已知會影響線粒體功能[ 19 ]，它與4種基因在早期WD中的差異甲基化相互作用：ATP1A1腕铸，CACNA1H惜犀，TNNC1和VIPR2（p ?= 1.2E-4）。WD特異性肝臟DMR基因顯著富集與美法侖的相互作用狠裹，后者已被用于治療肝臟轉(zhuǎn)移[ 20 ]向拆，并與FANCC，GSTP1酪耳，MGMT浓恳，OPLAH和PLAT基因相關(guān)（p ?= 6.5E-4）刹缝。雖然這些藥物對WD病理學的影響無法根據(jù)此分析進行預測，但這些數(shù)據(jù)確實提出了在WD模型系統(tǒng)中進一步研究的化合物颈将。

WD相關(guān)的肝臟甲基化不受細胞類型變化的影響

在諸如肝臟的大塊組織中觀察到的DNA甲基化變化可受到樣品之間各個細胞類型的比例差異的影響梢夯。為了確定細胞類型的變化是否影響本研究中鑒定的DMR，我們檢測了人肝細胞（HEP）晴圾，肝星狀細胞（HSC）或肝竇上皮細胞（LSEC）中特異性高甲基化的啟動子組[ 21 ]颂砸。在所有已鑒定的WD DMR中，只有63種WD特異性死姚，3種早期WD特異性和86種WD進展DMR與細胞類型特異性甲基化啟動子重疊（附加文件1）：圖S6a）人乓。來自每次比較的少于5％的DMR位于細胞類型特異性甲基化啟動子。在用于鑒定DMR的所有樣品組之間比較細胞類型特異性啟動子的甲基化百分比（附加文件1：圖S6b-d都毒，附加文件2：表S9）色罚。大多數(shù)細胞類型特異性啟動子在任何樣品組之間沒有差異甲基化。與HC相比账劲，WD樣品在7％的HEP啟動子戳护，4％的HSC啟動子和7％的LSEC啟動子上名義上差異甲基化（p ?<0.05）。與早期WD相比瀑焦，在晚期觀察到最大的影響腌且，其中8％的HEP啟動子，9％的HSC啟動子和13％的LSEC啟動子名義上差異甲基化（p?<0.05）榛瓮。這些結(jié)果表明铺董，細胞類型比例的改變對WD肝臟中觀察到的差異甲基化沒有主要影響。

血液中的DMR將WD與對照區(qū)分開來

雖然肝臟WD特異性DMR的鑒定與疾病見解最相關(guān)禀晓，但我們詢問是否可以在更易獲得的血液樣本中鑒定出類似的表觀基因組特征作為潛在的WD生物標志物柄粹。在兩個獨立的群組中共有82個全血樣品可用于DNA提取和甲基化組分析（附加文件1：表S10，附加文件2：表S11）匆绣。WD患者均在診斷時招募驻右，而不是抗銅治療。對于NAFLD和PSC受試者崎淳，從無纖維化到肝硬化堪夭，可直接從肝臟活組織檢查或非侵入性評估獲得纖維化階段。WD的全血甲基化組（n? = 40）拣凹，HC（n?= 12）森爽，并且通過WGBS評估DC（其包括NAFLD和PSC患者，n? = 20）嚣镜，并且針對每個成對比較調(diào)用DMR（圖 5a）爬迟。鑒定出187個高甲基化和75個低甲基化的WD特異性DMR，區(qū)分WD與HC和DC患者菊匿。在這些WD-特定血液的DMR使用甲基化水平付呕，大部分患者從WD HC和DC患者分離（圖 5 B计福，C）。相反徽职，大多數(shù)DMR中的甲基化與人口統(tǒng)計學協(xié)變量無關(guān)（附加文件2：表S12）象颖。

圖5

血液DMR區(qū)分WD患者與對照組。鑒定了 WGBS衍生的DMR姆钉，其區(qū)分WD與HC和DC说订，但不區(qū)分來自HC的DC（WD n? = 40，HC n? = 12潮瓶，DC n? = 20）陶冷。b使用WD特異性血液DMR中的甲基化，HC毯辅，WD埂伦，NAFLD和PSC血液的熱圖。繪制每個樣品相對于每個DMR的平均甲基化的甲基化百分比悉罕。c在WD特異性血液DMR中使用甲基化的主成分分析赤屋。省略號顯示95％的置信區(qū)間

由于肝臟增強子中肝臟WD特異性DMR的富集立镶，還評估了血液WD特異性DMR中的染色質(zhì)狀態(tài)富集（附加文件1：圖S7）壁袄。總體而言媚媒，DMR富集了免疫細胞增強子區(qū)域嗜逻，尤其是在造血干細胞中預測的那些，其重疊51％的DMR（優(yōu)勢比= 9.1缭召，F(xiàn)DR q ?= 6.1E-58）栈顷。另外，高甲基化區(qū)域在單核細胞嵌巷，中性粒細胞萄凤，B細胞和自然殺傷細胞增強劑中富集更多，而低甲基化區(qū)域在T細胞增強劑和啟動子中更富集搪哪。

血液中的DNA甲基化反映了WD特異性肝臟DMR的一個子集

正如預期的那樣靡努，血液中鑒定的WD特異性DMR的數(shù)量遠低于肝臟中鑒定的數(shù)量。然而晓折，血液DMR附近的99個（22％）基因與肝臟中鑒定的基因重疊惑朦，顯著富集（Hyper：p ?= 1.1E-25，Hypo：p ?= 2.0E-6漓概，附加文件1：圖S8a） 漾月。在血液和肝臟中具有重疊位置和共同方向的10個DMR附近的基因包括CSAD，ITGB7胃珍，LSM12梁肿，PSMD9蜓陌，RRN3P2，SNX29P2和PFN3栈雳。特別是护奈，HDAC5內(nèi)含子和LSM12上游的肝臟DMR在WD肝臟和血液中特異性地和顯著地高度甲基化（附加文件1：圖S8b-d）。

人和小鼠WD DMR基因在組織內(nèi)和組織之間重疊

為了確定與ATP7B功能喪失相關(guān)的DMR基因是否在人和小鼠之間保守哥纫，肝臟和血液中的人DMR基因與先前在WD模型tx-j小鼠的胎肝中鑒定的DMR基因重疊霉旗，與野生型C3H小鼠相比較。 （附加文件1：圖S9蛀骇，附加文件2：表S13）[ 15 ]厌秒。在人肝臟和小鼠胎肝中，20個基因在相同方向上差異甲基化（hyper：q ?= 7.7E-2擅憔，hypo：q ?= 4.7E-4）鸵闪。在ATP7B功能喪失時具有保守差異甲基化的基因中有ALKBH5，GRID2IP暑诸，KDELR2蚌讼，CACNA1H，CAMK2B和WNT11个榕。在血液中篡石，7個基因在與小鼠胎肝相同的方向上差異甲基化（hyper：q ?= 6.6E-3，hypo：q ?= 1.3E-1）西采。其中凰萨，ZNF750和MAD1L1在人肝臟中也是差異甲基化的。這些基因的保守差異甲基化表明它們代表了WD病理學中重要的早期擾動械馆。

血液中的DMR區(qū)分患有肝臟和神經(jīng)系統(tǒng)WD表型的患者

表型變異是WD的一個重要特征胖眷，不能通過基因型解釋，因此我們分析了血液中的甲基化霹崎，以確定是否存在分化WD肝采翰蟆（WDH）和神經(jīng)系統(tǒng)（WDN）癥狀的WD患者（WDH n? = 20，WDN n）? = 20）尾菇【澄觯總共1346個區(qū)域的甲基化了，而1514個區(qū)域被在WD患者肝癥狀低甲基化相比错沽，那些與神經(jīng)癥狀（圖 6的a簿晓，b）∏О＃患者可以通過表型清楚地聚集憔儿，表明血液中存在與WD癥狀相關(guān)的表觀遺傳差異。相反放可，WD表型DMR中的甲基化與協(xié)變量無關(guān)（附加文件2：表S14）谒臼。所有DMR附近的基因都富集了異常B細胞生理學中的功能朝刊，而WDH中低甲基化區(qū)域附近的基因富含癡呆，精神衰退和屬于染色質(zhì)修飾多梳抑制復合物1（PRC1）的功能（圖6）蜈缤。 C）拾氓。類似于WD特異性血液DMR，WD表型DMR富含免疫細胞增強劑底哥，尤其是造血干細胞中的那些（附加文件1：圖S7c咙鞍，d）。獨特地趾徽，WD表型DMR富含二價增強子续滋，其由H3K4me1和H3K27me3定義并由PRC1調(diào)節(jié)，并且特別富集在T細胞中（優(yōu)勢比= 4.6孵奶，F(xiàn)DR q ?= 1.5E-171）疲酌。

圖6.jpg

)

血液DMR區(qū)分患有肝（H）或神經(jīng)（N）WD的患者。鑒定了區(qū)分WDH和WDN的DMR了袁。一個使用甲基化WDH與WDN血液的DMR熱圖朗恳。繪制每個樣品相對于每個DMR的平均甲基化的甲基化百分比（WDH n? = 20，WDN n? = 20）载绿。b使用WDH中甲基化與WDN血液DMR的主成分分析粥诫。省略號顯示95％的置信區(qū)間。c與背景相比卢鹦，WDH與WDN血液DMR的GREAT功能富集分析的結(jié)果臀脏。來自FDR的基因本體數(shù)據(jù)庫的術(shù)語q?顯示<0.05劝堪，虛線表示顯著性閾值冀自。“所有DMR”（綠色）指高甲基化和低甲基化DMR; “低甲基化DMR”（藍色）是指與WDN相比在WDH中具有較低甲基化的DMR

WD表型血液DMR在獨立隊列中對肝臟和神經(jīng)系統(tǒng)WD進行分類

使用基于血液的生物標志物區(qū)分WD表型在患者診斷中具有潛在的應用秒啦。為了評估所鑒定的WD表型血液DMR的準確性以將WD患者分類為肝臟或神經(jīng)形式熬粗，在原始患者群組中對Adaboost分類器在這些區(qū)域中的血液甲基化進行訓練并且在獨立群組上進行測試（WDH n? = 5） ，WDN n? = 5）余境。識別出44個DMR驻呐，其特征重要性大于零，并用于模型中（圖 7a芳来，b）含末。這些DMR附近的基因包括幾個具有已知神經(jīng)功能的基因，如CHRNB3即舌，CYP46A1佣盒，GALR1，LHX4顽聂，NGF肥惭，NPTXR盯仪，SHH和WNT7B，和肝功能蜜葱，包括ONECUT1（圖 7 C全景，附加文件2：表S15）。重要的是牵囤，分類器能夠正確地識別除了一個獨立測試樣品之外的所有樣品爸黄，其具有WD的肝臟或神經(jīng)形式（精確度= 0.9，曲線下的接收器操作特征（ROC）面積（AUC）= 0.8揭鳞，圖3）馆纳。 7 d）。這些結(jié)果表明汹桦，在這44個區(qū)域中使用血液DNA甲基化的患者中可以鑒定出WD表型鲁驶。

圖7

選擇的WD表型血液DMR在獨立的測試組中對來自神經(jīng)系統(tǒng)WD的肝臟進行分類。使用AdaBoost算法的分類器用WD患者血液中WD表型DMR的甲基化值訓練（WDH n? = 20舞骆，WDN n? = 20）钥弯。a訓練后2860個DMR中的每一個都確定了特征重要性。b在訓練樣本中使用甲基化的分類器中使用的44個DMR的熱圖督禽。c特征重要性≥0.04的DMR附近的基因脆霎。d分類結(jié)果為WD患者的測試隊列。在圖中狈惫，該列代表真實的表型睛蛛，而顏色代表預測的表型（WDH n? = 5，WDN n?= 5胧谈，精度= 0.9忆肾，ROC AUC = 0.8）

討論

這是第一項通過WGBS在全基因組水平上研究WD患者甲基化變化的研究。這種表觀基因組特征揭示了肝臟特異性增強子和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點發(fā)生的甲基化變化菱肖，表明WD是一種遺傳性疾病客冈，其進展和潛在的發(fā)病機制與表觀遺傳變化有關(guān)。與健康受試者和患有其他肝病的受試者相比稳强，我們在WD患者中證實了特定的肝臟發(fā)病相關(guān)DNA甲基化標記鸿市。在來自不同隊列的患者的肝臟和血液中鑒定了這些DNA甲基化差異的子集芹橡，支持血液中的甲基化標記物可以反映另一組織中的疾病發(fā)病機理的前提。此外，DNA甲基化差異也基于肝臟與神經(jīng)系統(tǒng)表現(xiàn)區(qū)分患者充岛，特別是編碼具有機械意義的表觀遺傳因子的基因肪笋，例如PRC1中的那些犬庇。這些區(qū)域的一小部分可以在獨立的隊列中對WD患者表型進行分類思劳，證明了DNA甲基化的診斷潛力。WD的這種表觀基因組特征揭示了對基因途徑，基因 - 藥物相互作用和潛在生物標志物的見解蚜迅，這些可能在臨床上用于WD的早期干預和治療舵匾。證明了DNA甲基化的診斷潛力。WD的這種表觀基因組特征揭示了對基因途徑谁不，基因 - 藥物相互作用和潛在生物標志物的見解坐梯，這些可能在臨床上用于WD的早期干預和治療。證明了DNA甲基化的診斷潛力刹帕。WD的這種表觀基因組特征揭示了對基因途徑吵血，基因 - 藥物相互作用和潛在生物標志物的見解，這些可能在臨床上用于WD的早期干預和治療偷溺。

我們之前在WD的tx-j小鼠模型中的數(shù)據(jù)顯示蹋辅，胎兒肝臟中肝細胞生長和成熟缺乏的全面減少，通過母體膳食補充甲基供體膽堿來減輕[ 22 ]挫掏。在tx-j小鼠的胎肝中也觀察到差異甲基化侦另，其通過補充膽堿改善[ 15 ]。在患者肝臟中鑒定的差異甲基化基因與tx-j胎兒肝臟中的差異甲基化基因顯著重疊尉共，并且包括編碼在肝臟發(fā)育中重要的轉(zhuǎn)錄因子的幾個基因褒傅。GATA6參與肝臟成熟的多個階段，并在胎兒早期發(fā)育過程中在肝細胞中高表達[ 23 ]袄友。FOXA1在肝臟胚胎發(fā)生過程中啟動規(guī)范是至關(guān)重要的[ 24 ]并且也在成年肝臟中表達殿托，而VTN，一種FOXA1靶基因剧蚣，參與胚胎干細胞成熟[ 25 ]并且已經(jīng)顯示在胎兒肝星狀細胞中被上調(diào)[ 26 ]支竹。GATA6，FOXA1和的Vtn還發(fā)現(xiàn)在成年TX-J肝臟差異表達鸠按。WD的這些DNA甲基化特征指向肝臟發(fā)育和再生途徑礼搁，這些途徑又可能受胎兒和成年生命中甲基供體飲食因素的影響。

在WD中鑒定的高甲基化DMR特異性地富集在肝特異性增強子和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點中待诅，這是WD領(lǐng)域的新發(fā)現(xiàn)叹坦。肝特異性增強子中的高甲基化DMR可反映增強子使用或HNF4A結(jié)合的特定缺陷熊镣。HNF4A是肝細胞成熟的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子卑雁，是維持肝細胞上皮表型所必需的[ 27 ]。之前的一份報告顯示绪囱，WD患者HNF4A和RXR與啟動子反應元件的結(jié)合受損[ 28 ]测蹲。此外，肝臟X受體/類視黃醇X受體的失調(diào)與WD的發(fā)病機制有關(guān) [29]]鬼吵。發(fā)現(xiàn)HNF4A扣甲，RXR，F(xiàn)OXA1和FOXA2的肝結(jié)合位點在LRRC3的啟動子中顯著高度甲基化的WD特異性肝DMR處重疊。與早期WD相比琉挖，LRRC3的另一個DMR在晚期顯著高度甲基化启泣。以前，LRRC3與鉑誘導的肝損傷和氧化應激的易感性有關(guān)[ 30 ]示辈。我們的結(jié)果表明HNF4A和肝臟特異性增強子和啟動子中的其他轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點的高甲基化為WD發(fā)病機制中的這些先前分子發(fā)現(xiàn)提供了新的潛在解釋寥茫。

另外，從WD的這個表觀研究得到的見解可對有爭議銅累積和潛在的降低肝癌風險之間在WD [關(guān)系光棚31矾麻，32 ]纱耻。最引人注目的發(fā)現(xiàn)之一是肝臟和血液之間重疊的DMR基因在癌癥的表觀遺傳機制中起主要作用。特別是险耀，HDAC5活化與肝細胞增殖和肝癌發(fā)生有關(guān)[ 33 ]弄喘，并參與脂質(zhì)代謝和脂肪酸氧化[ 34 ]。無論NCOR2和CTBP2在WD患者的肝臟和血液中甲基化和功能在癌癥失調(diào)轉(zhuǎn)錄共抑制甩牺。NCOR2與兩個核受體蘑志，包括LXR和RXR，和IIa類HDAC的贬派，如HDAC5 [相互作用35卖漫，36 ]。NCOR2在膀胱癌赠群，乳腺癌和前列腺癌中也有差異表達[ 35 ]羊始。CTBP2的功能是在分化期間募集PRC2蛋白以添加H3K27me3，并且還與HDAC相互作用[ 37 ]查描。此外突委，CTBP2在前列腺癌中過表達并與腫瘤進展相關(guān)[ 38 ]。其他基因冬三，包括GATA2匀油，GADD45B和MIR126，WD肝臟和血液中的差異甲基化勾笆，也在癌癥的表觀遺傳機制中發(fā)揮作用敌蚜。WD中這些表觀遺傳調(diào)節(jié)因子的失調(diào)可能會影響這些患者對癌癥的易感性。

先前的幾項研究試圖將全血或外周血單核細胞（PBMC）中特定的DNA甲基化變化確定為肝病的指標窝爪。特別是弛车，對NASH患者的分析發(fā)現(xiàn)了與膠原蛋白含量相關(guān)的基因[ 11 ]和脂肪變性[ 39 ]的DNA甲基化變化]。我們的深入分析確定了可在診斷時區(qū)分早期和晚期WD和肝臟與神經(jīng)系統(tǒng)表型的DMR蒲每。據(jù)我們所知纷跛，這是第一項確定發(fā)病機制 - 有意義標志物組合的研究，以及與臨床和遺傳參數(shù)相關(guān)的診斷潛力邀杏。在我們對早期WD肝臟樣本的晚期分析中贫奠，我們發(fā)現(xiàn)了補體途徑中涉及的高甲基化基因，這些基因以前被證明是WD的血清生物標志物 [40]。]唤崭。我們的研究描述了一組來自全血的差異甲基化基因與WD肝臟中鑒定的基因重疊拷恨，表明這些基因座可以作為WD在未來研究中疾病進展的各個階段的潛在血液生物標志物。

該研究的局限性包括使用全血和全肝組織谢肾，因為兩者都是許多不同細胞類型的混合物挑随。在肝臟中評估細胞類型的影響，其中發(fā)現(xiàn)在特定肝細胞類型中大多數(shù)高甲基化的啟動子與WD肝臟中的差異甲基化無關(guān)勒叠。第二個限制是健康體重的個體缺乏肝臟控制兜挨。通過檢查與DMR甲基化無關(guān)的BMI來控制這一點。與脂肪酸氧化和脂質(zhì)分解代謝相關(guān)的途徑中基因的DNA甲基化的變化與WD動物模型中下調(diào)的脂質(zhì)代謝途徑的先前證據(jù)一致[ 8]眯分。第三個限制是甲基化分析的覆蓋率相對較低拌汇，這可能限制了檢測所有可能的甲基化差異的能力。然而弊决，相對大量的樣本允許我們捕獲大量的DMR噪舀，這些DMR在獨立群組中得到驗證，提供了WD中DNA甲基化作用原理的證據(jù)飘诗。此外与倡，所述測序方法的顯著成本可被視為DMR標記物作為WD診斷測試的未來適用性的限制因素。使用特定WD預測性DMR的減少表示將顯著降低成本昆稿，增加測序覆蓋率纺座，并使其成為臨床實踐的可訪問技術(shù)。

結(jié)論

WD代表一種非常獨特的遺傳條件溉潭，其中ATP7B中的突變與銅净响，飲食和代謝相互作用，影響其復雜和變化的表型喳瓣，因此血液或其他可及組織中疾病進展的表觀遺傳指示顯然在臨床上是有用的馋贤。這些DMR可能代表WD的表觀基因組特征，包括銅水平升高畏陕，疾病進展反應和飲食等環(huán)境輸入的直接改變配乓。此外，對編碼藥物可靶向表觀遺傳修飾因子（如HDAC5）的基因的DNA甲基化變化的鑒定可揭示對WD治療中現(xiàn)有藥物的再利用的見解惠毁。

方法

人體肝臟活組織檢查

來自WD患者的樣品獲自Heidelberg大學（德國海德堡）和加州太平洋醫(yī)學中心Ibrahim El-Hefni Biorepository（美國加利福尼亞州舊金山）犹芹。來自海德堡大學的肝臟樣本來自接受肝臟移植的WD患者的外植肝臟。來自加利福尼亞太平洋醫(yī)療中心的肝臟樣本是通過經(jīng)皮肝臟活組織檢查獲得的仁讨，用于診斷和分期目的羽莺。來自DC和HC受試者的肝樣品獲自加利福尼亞太平洋醫(yī)療中心和加州大學戴維斯GI生物庫（附加文件1：表S1，附加文件2）：表S2）洞豁。DC患者的經(jīng)皮肝臟活檢取自NAFLD。在患有非糖尿病的受試者的減肥手術(shù)時獲得HC肝臟活組織檢查，脂肪變性小于5％且組織學上無炎癥丈挟。如前所述刁卜，活組織檢查對炎癥，脂肪變性和炎癥進行分級[ 41 ]曙咽。

人體全血樣本

來自患有WD的患者（與提供肝臟活組織檢查的患者不同的組）的樣品獲自精神病學和神經(jīng)病學研究所（波蘭華沙）蛔趴。HC樣本來自華沙和薩克拉門托當?shù)厣鐓^(qū)的志愿者。DC樣本來自診斷為NAFLD和PSC的患者例朱，他們在加州大學戴維斯分校肝病學診所連續(xù)出現(xiàn)進行評估孝情，并同意提供全血用于DNA提取，以存儲在加州大學戴維斯分校生物庫中洒嗤。選擇NAFLD和PSC作為DC箫荡，因為在WD的鑒別診斷中應考慮這兩種條件，NAFLD患者呈現(xiàn)表觀遺傳變化渔隶，并且PSC也與銅積累相關(guān)羔挡。在HC和WD組中，全血樣本按年齡间唉，性別和BMI進行匹配（附加文件1：表S10绞灼，附加文件2：表S11）〕室埃患有其他慢性肝驳桶（包括乙型肝炎或丙型肝炎，自身免疫性肝炎被冒，酒精性肝病商佛，原發(fā)性膽汁性膽管炎，血色素沉著癥）的患者被排除在外姆打。根據(jù)萊比錫標準確定WD患者在診斷時被招募良姆，因此不進行抗銅治療。選擇測試組中的WD患者具有ATP7B H1069Q錯義突變幔戏。根據(jù)患者的流行表型將患者分類為肝臟或神經(jīng)系統(tǒng)表現(xiàn)玛追。將所有樣品去標識，在干冰上運輸闲延，并儲存在-80℃下用于進一步分析痊剖。

全基因組亞硫酸氫鹽測序（WGBS）和分析

使用TruSeq DNA甲基化試劑盒（Illumina，San Diego垒玲，CA陆馁，USA）從亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化的DNA制備WGBS文庫。來自肝臟和血液訓練樣品的文庫在HiSeq4000上測序合愈，而來自血液測試樣品的文庫在HiSeq2000（Illumina叮贩，San Diego击狮，CA，USA）上測序益老。將讀數(shù)與hg38參考基因組比對彪蓬，并在HC，WD和DC樣品之間鑒定DMR捺萌。WGBS數(shù)據(jù)分析的所有代碼都可以在GitHub上獲得（https://github.com/cemordaunt/WilsonDiseaseEpigenome）档冬。

關(guān)于WGBS數(shù)據(jù)分析和小鼠模型研究的其他方法在附加文件1：補充方法中給出。

非酒精性脂肪性肝蔡掖俊（NAFLD）和原發(fā)性硬化性膽管炎（PSC）