樣本前處理
上面的圖描述了整個(gè)蛋白質(zhì)組學(xué)的分析流程：咱們先從組織、體液或細(xì)胞中提取蛋白質(zhì)米绕，拿到蛋白混合溶液（根據(jù)你的研究目的款侵，可以對(duì)蛋白先做分離，或者不分離）湃累，接下來(lái)還原烷基化（還原的過(guò)程是將蛋白的二硫鍵打開勃救，然后烷基化可以修飾巰基，防止游離的巰基再生成二硫鍵）處理治力，并酶解成肽段蒙秒。紅線以上都屬于樣品的制備階段。
既然蛋白質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)的目的宵统，是為了盡可能準(zhǔn)確地對(duì)盡可能多的蛋白進(jìn)行檢測(cè)晕讲，那么，順理成章的马澈，我們做這些復(fù)雜的前處理的目的瓢省，就是要減少在實(shí)驗(yàn)階段對(duì)蛋白的人為降解和修飾，釋放盡可能多的肽段痊班，送進(jìn)質(zhì)譜來(lái)檢測(cè)勤婚。
為了更好地聊這個(gè)問(wèn)題，我們先來(lái)復(fù)習(xí)一下如何利用質(zhì)譜檢測(cè)蛋白質(zhì)涤伐，以此來(lái)反推前期樣品處理需要達(dá)到怎樣的目的馒胆。
拿到處理好的蛋白樣品以后，我們先將樣品酶解成肽段凝果，得到一級(jí)譜圖国章，再由肽段離子與惰性氣體碰撞生成碎片離子，得到二級(jí)譜圖豆村。然后我們用實(shí)驗(yàn)譜圖與理論譜圖進(jìn)行匹配液兽，從而判斷肽段的氨基酸組成，然后再根據(jù)肽段反推出蛋白質(zhì)掌动。
上圖的最下面是是數(shù)據(jù)庫(kù)里搜索的序列四啰，綠色部分是置信度在95%以上的肽段，紅色是置信度在50%以上的肽段粗恢「躺梗基于這些置信度比較高的肽段，我們才能推斷出這個(gè)蛋白存在于樣品中眷射。所以匙赞，對(duì)于每個(gè)蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō)佛掖，根據(jù)實(shí)驗(yàn)譜圖匹配到的肽段越多，對(duì)于這個(gè)蛋白的鑒定結(jié)果就越可信涌庭。
那么芥被，樣品預(yù)處理時(shí)，首要目的就是避免隨機(jī)降解坐榆，才能得到用特定蛋白酶特異性剪切得到的肽段拴魄，拿這些肽段生成的實(shí)驗(yàn)譜圖與理論譜圖比對(duì)，才能得到可靠的比對(duì)結(jié)果席镀。否則匹中，蛋白的隨機(jī)斷裂位點(diǎn)與特異性酶切位點(diǎn)根本對(duì)不上，那拿到的實(shí)驗(yàn)譜圖與理論譜圖完全就是兩回事豪诲，最后的結(jié)果就是顶捷，要么檢測(cè)不到蛋白，要么檢測(cè)到的都是錯(cuò)的屎篱。
樣本的收集與保存
樣本預(yù)處理之前焊切，我們需要先收集和保存樣品。這一步可不能馬虎芳室，如果收集的方法或者保存的方式不得當(dāng)专肪，就會(huì)嚴(yán)重影響后面的預(yù)處理步驟以及實(shí)驗(yàn)結(jié)果！以下三類樣品的收集與保存尤其需要留意：
組織樣品
1） 對(duì)于人體手術(shù)切除的組織堪侯，有條件的話嚎尤，最好用PBS（磷酸緩沖鹽溶液，作為溶劑伍宦，起溶解保護(hù)試劑的作用）取完之后直接去血芽死。如果沒(méi)有去血，可以-80℃液氮保存次洼，干冰運(yùn)輸关贵。
2）對(duì)于小鼠、大鼠卖毁、兔子之類的組織樣品揖曾，建議用灌流的方式來(lái)去血，尤其是像肝臟亥啦、胃炭剪、心臟這類大的組織，可以直接用灌流的方式去血翔脱，去得最干凈奴拦。其次的方案是在后期剪碎的時(shí)候去血。
話說(shuō)届吁，這里為什么要強(qiáng)調(diào)去血呢错妖？因?yàn)檠褐杏惺畮追N含量特別高的高豐度蛋白質(zhì)绿鸣，占了血液蛋白總量的95%，如果你的研究目標(biāo)并不包括血液蛋白暂氯，而這部分蛋白又存在于樣品中潮模，那就悲劇了。大家回憶一下株旷，我們第一節(jié)課的聽課筆記中專門提到的數(shù)據(jù)依賴性采集（DDA）再登，當(dāng)樣品中有大量高豐度蛋白的時(shí)候尔邓，來(lái)自中低豐度蛋白的肽段信號(hào)就會(huì)被大大抑制晾剖，連進(jìn)入二級(jí)質(zhì)譜的機(jī)會(huì)都會(huì)變得很渺茫，還怎么愉快地檢測(cè)梯嗽？
細(xì)胞樣品
常規(guī)實(shí)驗(yàn)齿尽，建議收到5*1E6-1E7個(gè)細(xì)胞以上的樣品量（有些實(shí)驗(yàn)需要的樣品量會(huì)少一些，后面會(huì)詳細(xì)講）灯节。細(xì)胞取好后循头，首先用PBS清洗一下細(xì)胞表面，因?yàn)榇蟛糠峙囵B(yǎng)基里面都含有血清炎疆，這部分血清得洗干凈了先~
如果是做分泌蛋白研究的話卡骂，首先用PBS清洗樣品幾次，再用條件培養(yǎng)基（不含有血清的培養(yǎng)基）進(jìn)行培養(yǎng)形入，根據(jù)細(xì)胞情況全跨，大概12個(gè)小時(shí)以后，離心亿遂，去掉細(xì)胞碎片浓若，取上清，就能提取到分泌蛋白了蛇数。
血清樣品
1）血漿樣品：可以通過(guò)醫(yī)院常用的EDTA抗凝管進(jìn)行收集挪钓，收集到的血漿會(huì)呈懸浮狀態(tài)，離心去掉血細(xì)胞耳舅。
2）血清樣品：現(xiàn)在大部分研究都直接針對(duì)血清樣品碌上，它的成份更簡(jiǎn)單，沒(méi)有凝集素浦徊，沒(méi)有大量的血細(xì)胞绍赛，針對(duì)性會(huì)更強(qiáng)。收集血清樣品時(shí)辑畦，直接把血清吸到管子里吗蚌，室溫靜置讓它凝結(jié)，上清黃色部分就是血清樣品啦纯出。
好蚯妇，我們收集好樣品后敷燎，接下來(lái)就開始做樣品前處理了。它分幾步走呢箩言？看下圖：
對(duì)于以上這些步驟硬贯，后面會(huì)詳細(xì)聊，這里我們先做點(diǎn)兒背景鋪墊陨收，大伙兒心里先有個(gè)譜：
鋪墊
鋪墊之一：第二步“充分溶解蛋白”尤為重要饭豹，如果蛋白沒(méi)有充分溶解，能提取到的蛋白就會(huì)很少务漩，達(dá)不到研究目的拄衰。
鋪墊之二：在第一、二步饵骨，即破碎樣品和溶解樣品的過(guò)程中翘悉，為了減少人為操作引入的修飾，通常會(huì)準(zhǔn)備大量的冰居触，進(jìn)行冰上的操作妖混。同時(shí)還需要加入蛋白酶抑制劑，防止在操作過(guò)程中蛋白被樣品中自帶的蛋白酶降解掉轮洋。
說(shuō)到樣品中自帶的蛋白酶制市，尤其要高度重視的是胰腺樣品，如果你在室溫下解凍弊予，整個(gè)樣品可以直接化成水祥楣。胰腺本身含有非常豐富的胰蛋白酶，在體外的室溫環(huán)境下块促，胰蛋白酶的活性沒(méi)有誰(shuí)來(lái)抑制它荣堰，于是可以完全釋放天性，把組織樣品里的蛋白都分解掉了竭翠！所以針對(duì)胰腺樣品振坚，要非常小心，必須在冰上操作斋扰，利用低溫環(huán)境控制蛋白酶的活性渡八。
鋪墊之三：關(guān)于第三步“解旋蛋白質(zhì)”。通常传货，蛋白質(zhì)都是成球狀的穩(wěn)定狀態(tài)屎鳍，解旋蛋白質(zhì)就是將球狀蛋白中的二硫鍵打開，讓它形成鏈狀結(jié)構(gòu)问裕，以便進(jìn)行下一步酶切逮壁。以下圖胰島素結(jié)構(gòu)圖為例，胰島素分子通過(guò)很多二硫鍵形成穩(wěn)定的球狀結(jié)構(gòu)粮宛，親水基團(tuán)主要集中在表面窥淆，而疏水基因都包裹在里面卖宠，如果用特異性酶直接作用于這些球狀蛋白，包裹在里面的序列就不容易被酶作用到忧饭，酶切的效率就會(huì)很低~
如果能將這些二硫鍵打開扛伍，球狀結(jié)構(gòu)被破壞，蛋白分子就會(huì)變成鏈狀词裤，酶切位點(diǎn)才能盡可能多地暴露在酶環(huán)境里刺洒，這時(shí)候我們?cè)偌尤胩禺愋悦福湍艿玫礁嗟拿附怆亩巍?/p>
鋪墊之四：對(duì)于第五步去除雜質(zhì)吼砂，其實(shí)伴隨著整個(gè)預(yù)處理的過(guò)程逆航。雜質(zhì)都是從哪里來(lái)的呢？比如帅刊，從組織中帶來(lái)的雜質(zhì)纸泡，提取溶液漂问、酶解樣品中帶來(lái)的鹽等赖瞒。我們要知道，質(zhì)譜是一個(gè)非常靈敏的儀器蚤假，它檢測(cè)的是多肽的質(zhì)荷比栏饮。所有的鹽類，以及所有會(huì)進(jìn)行離子化的雜質(zhì)磷仰，都會(huì)干擾到肽段的檢測(cè)袍嬉。所以我們會(huì)要求進(jìn)入質(zhì)譜之前的蛋白樣品非常干凈。在蛋白水平及肽段水平都會(huì)進(jìn)行去除雜質(zhì)的步驟灶平。
樣品的破碎
好伺通，接下來(lái)我們就從破碎樣本開始，詳細(xì)聊聊每一步具體應(yīng)該怎么做逢享，需要用到哪些方法罐监、工具和試劑，以及操作的技巧和需要注意的那些小細(xì)節(jié)瞒爬。
第一步 破碎樣品
樣品破碎的方法主要分三類：
機(jī)械破碎
1）液氮研磨：適用于大部分組織樣品弓柱，比如常見(jiàn)的胃臟樣品、腸樣品侧但、肝臟樣品等矢空。把所有的器皿、研缽禀横，以及樣品屁药，都放到-80℃環(huán)境下，然后把樣品放到研缽里柏锄，倒入液氨酿箭，整個(gè)樣品會(huì)凍得非常脆立莉，然后就大力研磨，直到磨成粉末七问。
2）勻漿：適用于亞細(xì)胞器的破碎蜓耻，使用Dunce勻漿器。注意哈械巡，勻漿沒(méi)有液氨研磨那么劇烈刹淌，除亞細(xì)胞器以外的蛋白提取，通常還是建議用液氨研磨讥耗，破碎得更充分一些有勾。
3）搗碎法：用研磨的方法破碎樣品，如果樣品量又大古程，那可是件非常辛苦的事情蔼卡！于是一些公司推出了細(xì)胞破碎儀，利用玻璃珠或者磁珠劇烈地震蕩挣磨，或者用刀片高速旋轉(zhuǎn)雇逞，總之，用電力代表人力茁裙，幫助我們做樣品破碎塘砸。
物理破碎
1）溫差法：通常用于含有細(xì)胞壁的樣品，比如一些細(xì)菌樣品晤锥，利用高溫和低溫的反復(fù)變化掉蔬，破壞細(xì)胞壁。
2）壓力差法：適用于組織樣品矾瘾，通過(guò)高壓和低壓的反復(fù)變化女轿，實(shí)現(xiàn)對(duì)組織樣品的破碎。
3）超聲破碎法：適用于細(xì)胞層次的樣品壕翩。
化學(xué)處理
使用各種水解酶蛉迹、變性劑或表面活性劑等，破碎細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)戈泼，導(dǎo)致細(xì)胞的破碎婿禽。
事實(shí)操作中呢，我們通常會(huì)將幾種方法結(jié)合起來(lái)使用大猛。比如先液氨研磨扭倾，拿去提取蛋白，檢測(cè)一下蛋白含量挽绩，發(fā)現(xiàn)破碎不夠充分膛壹，于是又再用超聲的方法，或者結(jié)合比較強(qiáng)的變性劑的方法等等，增強(qiáng)樣品破碎的程度模聋，釋放更多的蛋白肩民。
說(shuō)到化學(xué)處理法，我們來(lái)看看樣品前處理中會(huì)用到哪些抽提試劑吧链方。
上面列出的一些重要的試劑持痰，我們來(lái)詳扒一下：
8M尿素：這是比較強(qiáng)的變性劑，有時(shí)也會(huì)用6M尿素祟蚀。
需要注意的是工窍，在加入8M尿素以后，所有處理過(guò)程不能超過(guò)37℃前酿，否則會(huì)將蛋白質(zhì)的氨基胍基化患雏，影響蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)，影響后續(xù)的酶解罢维，以及質(zhì)譜檢測(cè)淹仑，后果很嚴(yán)重！另外肺孵，如果這一步你用了8M尿素匀借，后面又要用胰酶來(lái)做酶解，那么加入胰酶之前悬槽，一定要先將尿素稀釋到1M怀吻，否則高濃度的尿素會(huì)讓胰酶也變性瞬浓，失去活性初婆。
硫脲：能起到助溶的效果，也是一種還原劑猿棉，它的還原性與一些試劑盒是不兼容的磅叛，比如BCA試劑盒。
Tips: 處理過(guò)程中,我們要注意每一步的溶劑是否與下一步的溶劑兼容（兼容的意思就是萨赁，能不能一起使用）弊琴。根據(jù)它們的兼容性來(lái)進(jìn)行選擇。
4%SDS：很強(qiáng)的去污劑杖爽，但與胰酶不兼容敲董，并且很難通過(guò)超濾的方法脫去的，它在超濾脫鹽的過(guò)程中仍保留在蛋白樣品中間慰安。對(duì)于這類去污劑腋寨，我們通常會(huì)利用有機(jī)溶劑來(lái)去除它們，比如丙酮沉淀化焕。
Tips: 這些去污劑萄窜，在樣品進(jìn)入質(zhì)譜前都要去除干凈，否則它們會(huì)在質(zhì)譜的電場(chǎng)下離子化，影響我們的分析查刻。因此呢键兜，去污劑要慎用！
還原劑：功能是打開二硫鍵穗泵，使蛋白分子盡量從球狀變成鏈狀普气，增加蛋白質(zhì)的溶解性，以及暴露出盡可能多的酶切位點(diǎn)佃延。
蛋白酶抑制劑：夏天尤其需要棋电，當(dāng)溫度比較高的時(shí)候，酶的活性也會(huì)較高苇侵，蛋白樣品很容易發(fā)生自降解赶盔。如果做特殊樣品的處理，比如磷酸化樣品或其它翻譯后修飾樣品的富集榆浓，要針對(duì)性地加入這一類酶的抑制劑于未。
有機(jī)試劑：用來(lái)沉淀蛋白質(zhì)，去除雜質(zhì)陡鹃。比如前面提到的去污劑烘浦，我們就可以利用有機(jī)試劑來(lái)去除它們；另外萍鲸，針對(duì)植物樣品或昆蟲樣品闷叉，樣品本身含有很多色素，比如葉綠素脊阴，昆蟲翅膀上的色素等握侧，也可以用有機(jī)試劑將色素溶解掉，然后進(jìn)行洗滌嘿期。
特別注意：整個(gè)處理過(guò)程中品擎，所有使用的EP管、槍頭备徐、裝試劑的塑料瓶萄传，都盡量用進(jìn)口的產(chǎn)品，尤其是當(dāng)使用到強(qiáng)溶解性的溶液蜜猾！國(guó)產(chǎn)的EP管上的材料（聚乙二醇）很容易被這些溶液洗脫下來(lái)秀菱，進(jìn)入樣品中，并且很難洗脫掉蹭睡。而聚乙二醇非常容易離子化衍菱，會(huì)在質(zhì)譜里形成很強(qiáng)的塑料峰，甚至?xí)耆谏w目標(biāo)肽段的峰棠笑，造成檢測(cè)的失斆瓮搿！
