什么是線粒體基因
線粒體是參與細胞凋亡啟動和執(zhí)行的主要細胞器之一癌蚁。線粒體基因在大多數(shù)細胞中表達赶站，其表達水平是細胞類型特異性的绰上。也就是說這個也是和細胞類型及其狀態(tài)有關系的泡垃。
為什么要處理
因為線粒體基因的高表達水平可能是:
- 樣品質(zhì)量差析珊，導致大量細胞凋亡或裂解。
- 特定樣本的生物學蔑穴，例如腫瘤活檢唾琼，可能由于代謝活動和/或壞死而增加線粒體基因表達。
凋亡細胞表達線粒體基因澎剥，并將這些轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物輸出到哺乳動物細胞的細胞質(zhì)中锡溯。例如，當?shù)蛲龅募毎环湃胝５募毎麘乙褐醒埔Γ瑫z測到更多的線粒體基因祭饭。檢測到的線粒體膜占總膜的百分比如圖所示
線粒體是參與細胞凋亡啟動和執(zhí)行的主要細胞器之一。細胞凋亡的過程依賴于一系列信號事件叙量，包括線粒體基因表達的增加和半胱天冬酶的激活倡蝙。因此，我們在計算每個樣本中源自線粒體基因表達的UMIs數(shù)量時绞佩，評估了獨特轉(zhuǎn)錄本的比例寺鸥。在> 80%活細胞的高質(zhì)量樣品中，我們只檢測到低比例的線粒體細胞(約3%)品山。與預期的一樣胆建，在只包含20%活細胞(74%)的Digitonin高樣本中，線粒體轉(zhuǎn)錄本的數(shù)量最高肘交。相比之下笆载，含有50%活細胞的樣本只顯示線粒體基因表達略有增加(5-7%)，這表明存活率確實與觀察到的線粒體轉(zhuǎn)錄本數(shù)量相關涯呻。
被裂解的細胞或細胞膜被破壞的細胞釋放它們的細胞質(zhì)轉(zhuǎn)錄本凉驻，而線粒體轉(zhuǎn)錄本可能仍然保留在雙膜結合的線粒體內(nèi)。具有完整線粒體的裂解細胞可能被gems包裹复罐，這也增加了檢測到的線粒體轉(zhuǎn)錄片段的概率涝登。
如何處理
一般我們建議卡到30%以內(nèi)，當然還是要看這群細胞為什么會高效诅。建議是不卡閾值直接做降維分群胀滚，然后按分群來看小提琴圖咳短，如果只有一個或幾個細胞群有差異的線粒體轉(zhuǎn)錄上調(diào)和低總UMI計數(shù)，這個群最有可能代表一個死亡或頻臨死亡的細胞群蛛淋。此時咙好，再去不遲。
另外一點褐荷，我們注意到勾效，cellranger3比cellRanger 2檢測的MT（人的是MT開頭的基因，其他物種主要找到相應的基因）高的細胞更多叛甫。這主要是因為：cellRanger3或更高版本具有比版本2中的cell calling算法更敏感层宫，新算法基于EmptyDrops方法(Lun et al.， 2018)其监。這種方法可以檢測到之前版本算法所遺漏的細胞萌腿，特別是死亡或垂死的細胞，RNA含量自然較低的細胞抖苦，或異質(zhì)性樣本中的細胞毁菱。
這就也是為什么我們會主動地看看細胞中MT基因表達的原因，選擇從下游分析中排除這些細胞锌历。而在cellranger count管道中贮庞，沒有直接的方法可以排除線粒體豐富的細胞。但是究西，您可以使用下面兩種方法中的任何一種來間接完成此任務窗慎。
- Using Cell Ranger and Loupe Cell Browser
質(zhì)量差的細胞通常有低總UMI計數(shù)，很少有上調(diào)基因(表明低總基因表達)卤材，而只有MT基因過表達遮斥。例如，在下面的圖中扇丛，您可以看到基于圖形的聚類t-SNE圖中聚類1(頂部的青色聚類)的基因表术吗。與上述鑒定死亡細胞的標準一致，在這個群集中只有線粒體基因上調(diào)晕拆。對cluster 9中的細胞也進行了類似的觀察藐翎。
下面的圖顯示，與其他細胞相比实幕，Cluster1和Cluster19中的細胞的總UMI計數(shù)也很低。
您可以從一個cellranger count 輸出文件中獲得Cluster1和9中細胞的條形碼堤器。默認的分群結果(基于圖)在Cell Ranger輸出的“ANALYSIS”路徑中昆庇。例如，在下面的圖中闸溃，cluster 1和cluster 9的細胞高表達了MT整吆。這些cluster的條形碼可以在輸出文件中找到:outs/analysis/clustering/graphclust/cluster.csv
您也可以使用Loupe細胞瀏覽器下載的非MT豐富細胞拱撵。為此，首先去除富集MT的cluster1和9表蝙。然后使用“導出”功能在Loupe Cell瀏覽器如下拴测。
步驟2。使用cellranger reanalyze重新運行二級分析并生成一個新的cloupe文件府蛇，不使用MT高表達的barcode集索。要指定條形碼，需要使用——barcodes選項汇跨。
- Seurat
第二種方法就是我們經(jīng)典的Seurat务荆。第三方工具如Seurat可用于篩選線粒體基因表達率高的細胞。請在這里找到更多的信息穷遂。(章節(jié)“QC和選擇細胞進行進一步分析”)
單細胞轉(zhuǎn)錄組||Seurat新版教程:Guided Clustering Tutorial
https://kb.10xgenomics.com/hc/en-us/articles/360001086611-Why-do-I-see-a-high-level-of-mitochondrial-gene-expression-
https://kb.10xgenomics.com/hc/en-us/articles/360026505392-Why-do-I-see-more-MT-enriched-cells-from-Cell-Ranger-3-compared-to-Cell-Ranger-2-
https://kb.10xgenomics.com/hc/en-us/articles/360026508452-How-can-I-exclude-poor-quality-cells-such-as-cells-that-show-enrichment-of-MT-genes
