volcano plot 火山圖

火山圖（Volcano Plot）是做RNA-Seq分析的時(shí)候特別常用的一張圖铺呵，因?yàn)樗梢苑浅Ｇ逦恼故境瞿男┗蚴俏覀冋嬲胍娘@著性的基因盛正。

我們看看火山圖長(zhǎng)什么樣子

百度圖片搜volcano plot隨便找了一張

下面說(shuō)明如何看懂和繪制火山圖

標(biāo)準(zhǔn)的火山圖常用于展示顯著差異表達(dá)的基因关摇，這里有兩個(gè)關(guān)鍵詞：顯著是指P<0.05，差異表達(dá)一般我們按照Fold Change(倍數(shù)變化)>=2.0作為標(biāo)準(zhǔn)肆汹。
當(dāng)我們拿到基因表達(dá)的P值和Fold Change后愚墓，為了用火山圖展示結(jié)果，一般需要把倍數(shù)進(jìn)行Log2的轉(zhuǎn)化昂勉，比如某基因在實(shí)驗(yàn)組表達(dá)水平是對(duì)照組的4倍浪册，log2（4）=2，同樣的如果是1/4硼啤，也就是0.25议经，轉(zhuǎn)換后的結(jié)果就是-2斧账。

同樣的道理，對(duì)P值進(jìn)行-log10的轉(zhuǎn)化煞肾，-log10（0.05）約等于1.30103咧织，由于P值越小表示越顯著，所以我們進(jìn)行-log10（P value）轉(zhuǎn)化后籍救，轉(zhuǎn)化值越大表示差異約顯著习绢，比如-log10（0.001）=3 > -log10(0.01)=2 > -log10(0.05)=1.30。

上面看不懂沒(méi)關(guān)系蝙昙，舉例說(shuō)明：

RNA-Seq測(cè)序時(shí)會(huì)有一個(gè)對(duì)照組的樣本闪萄，一個(gè)處理組的樣本，處理組和對(duì)照組相比較奇颠，會(huì)發(fā)現(xiàn)某個(gè)基因表達(dá)量或變高了或變低了败去。用處理組的表達(dá)量除以對(duì)照組就會(huì)得到一個(gè)倍數(shù)，這個(gè)倍數(shù)就叫做Fold Change 烈拒，差異表達(dá)一般我們按照Fold Change(倍數(shù)變化)>=2.0作為標(biāo)準(zhǔn)圆裕。為了用火山圖更直觀的顯示結(jié)果我們要將橫軸的Fold Change進(jìn)行Log2處理，對(duì)縱軸的P值進(jìn)行-log10的處理荆几。
log2(fold change)=0也就是圖中間的位置吓妆，就相當(dāng)于：處理組fpkm/對(duì)照組fpkm=1也就是說(shuō)對(duì)照組和處理組之間的基因表達(dá)量是沒(méi)有變化的。所以說(shuō)出現(xiàn)在中間位置的點(diǎn)是表達(dá)量沒(méi)有發(fā)生變化的基因吨铸，越往右邊走就說(shuō)明這些基因的表達(dá)量在處理組比對(duì)照組大行拢，越往左走說(shuō)明相對(duì)于對(duì)照組來(lái)說(shuō)，處理組基因表達(dá)量變低诞吱。
在該圖中舟奠，不顯著的被設(shè)置成了粉色，顯著的設(shè)置成了綠色狐胎。

Y軸是cuffdiff算的統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)的P-value取了log10之后又取了一個(gè)負(fù)數(shù)鸭栖，所以說(shuō)-log10(P-value)越高代表著越顯著，也就是說(shuō)越往左上角和越往右上角的點(diǎn)是越顯著的點(diǎn)握巢。

我們用來(lái)自于cuffdiff的輸出文件gene_exp.diff畫(huà)圖，讀入R命令：

volcano_plot = read.table(file="gene_exp.diff文件路徑",header = T)

注：讀表用read.table函數(shù)
讀入后松却，看看這個(gè)表張什么樣子：

gene_exp.diff

• 第一列暴浦、第二列都是基因名；
• 第三列gene沒(méi)寫(xiě)因?yàn)橐呀?jīng)給了gene_id了晓锻；
• 第四列locus是該基因在基因組上位置歌焦；
• sample_1 sample_2就是取了個(gè)名字不用注意；
• status那列顯示的是砚哆，是否通過(guò)檢驗(yàn)独撇，顯示OK的就是進(jìn)行檢驗(yàn)的，顯示NOTEST就說(shuō)明表達(dá)量特別特別低不進(jìn)行檢驗(yàn)；
• p-value是做統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)看看是否顯著纷铣，q-value是對(duì)p-value進(jìn)行修正卵史，最終以修正過(guò)的q-value為準(zhǔn)，q-value<0.05才認(rèn)為是顯著的搜立。

準(zhǔn)備畫(huà)火山圖用到的X/Y軸

先準(zhǔn)備X軸—log2(fold change)

前面我們交代過(guò)了fold change=處理組fpkm/對(duì)照組fpkm
所以：

control_FPKM = volcano_plot$value_2  #對(duì)照組的fpkm
treat_FPKM = volcano_plot$value_1 #處理組的fpkm
log2_foldchange = log2(treat_FPKM / control_FPKM) #處理組fpkm/對(duì)照組fpkm

我們可以看到我們這里重新賦值求的log2_foldchange以躯，原來(lái)的表格里有log2.fold_change這一列，為什么還要重新求呢啄踊？因?yàn)樵瓉?lái)表格里求反了求的是：對(duì)照組fpkm/處理組fpkm忧设，我們這里改正下。
我們看下計(jì)算好的log2_foldchange里面有很多的Inf和NaN颠通，這是怎么回事址晕？

> log2_foldchange
   [1]  0.3382477530 -0.4605051707 -0.0964487964 -0.0249217524  0.7042396503           NaN           Inf
   [8] -0.9036291456           NaN           NaN  0.4595512248 -0.2834890803 -0.1511719401          -Inf
  [15]           Inf           NaN           NaN           NaN  0.4606267258  0.1979788743  0.1460252515
  [22] -0.3713316852 -0.9538916822 -0.2045978915 -0.2938850235  0.2349539904  0.3777615202  0.4461331227
  [29] -0.1815706646 -1.0014515800           Inf -0.3531645487  0.1261928713  2.8901005944          -Inf
  [36] -0.0146452448 -0.8561317308 -0.1874764797  0.5134263089 -0.0978467676 -0.3708083209  0.8298739826

這是因?yàn)橛行ヽontrol組基因的FPKM是0，除數(shù)是零顿锰，是不符合數(shù)學(xué)規(guī)則的谨垃，所以會(huì)出現(xiàn)這種情況。
我們需要處理下：
control_FPKM == 0 判斷一下control_FPKM的值是否等于0
把control_FPKM == 0即除數(shù)是0的全都篩選出來(lái)

> log2_foldchange[control_FPKM == 0 ]
   [1] NaN Inf NaN NaN Inf NaN NaN NaN Inf Inf NaN NaN NaN Inf NaN NaN NaN NaN Inf Inf NaN NaN NaN NaN NaN NaN
  [27] NaN NaN NaN NaN NaN NaN NaN NaN NaN NaN NaN NaN NaN NaN NaN NaN NaN NaN NaN NaN Inf Inf NaN NaN NaN NaN
  [53] NaN NaN Inf NaN NaN NaN NaN NaN NaN NaN NaN NaN NaN NaN NaN NaN NaN NaN NaN NaN Inf NaN NaN NaN Inf NaN

我們可以看到經(jīng)過(guò)log2_foldchange[control_FPKM == 0 ] 操作撵儿，把log2_foldchange里的所有 NaN / Inf 選出來(lái)了乘客，之后我們把篩選出的 NaN / Inf 強(qiáng)行賦值為0

log2_foldchange[control_FPKM == 0 ] = 0 

查看新生成的log2_foldchange發(fā)現(xiàn)還有一些-Inf

> log2_foldchange
   [1]  0.3382477530 -0.4605051707 -0.0964487964 -0.0249217524  0.7042396503  0.0000000000  0.0000000000
   [8] -0.9036291456  0.0000000000  0.0000000000  0.4595512248 -0.2834890803 -0.1511719401          -Inf
  [15]  0.0000000000  0.0000000000  0.0000000000  0.0000000000  0.4606267258  0.1979788743  0.1460252515
  [22] -0.3713316852 -0.9538916822 -0.2045978915 -0.2938850235  0.2349539904  0.3777615202  0.4461331227
  [29] -0.1815706646 -1.0014515800  0.0000000000 -0.3531645487  0.1261928713  2.8901005944          -Inf
  [36] -0.0146452448 -0.8561317308 -0.1874764797  0.5134263089 -0.0978467676 -0.3708083209  0.8298739826
  [43]  1.8493688172  0.0889640074  0.3113824129  0.0000000000  1.1102702040 -0.2531163954  0.0957645721
  [50] -0.6889365003  0.0000000000  0.0000000000  0.4828096335          -Inf -0.0058634211 -0.1436717399
  [57] -0.2029754567  1.9504284898 -0.2426462728 -0.3974959807  0.7211822730 -0.2428425868  0.5005116514
  [64]  0.3829284571 -0.0027983348  0.2696816982 -0.1575258190 -0.5746841946 -0.2751886483  0.0894799450
  [71] -0.1773208535 -1.6980255555  0.0000000000  0.5061142478  0.3639842228          -Inf -0.1930460419

這是因?yàn)楫?dāng)treat_FPKM=0即分母是0時(shí)，求log2就等于負(fù)無(wú)窮-Inf
所以淀歇，同理易核，我們把treat_FPKM也處理一下，把log2_foldchange里所有的-Inf賦值為0浪默，這時(shí)我們就把畫(huà)圖過(guò)程中的異常點(diǎn)過(guò)濾掉了牡直。

log2_foldchange[treat_FPKM == 0 ] = 0

此時(shí)log2_foldchange里所有的數(shù)都是有效數(shù)字了，原來(lái)NaN / Inf的地方都變成0啦~

準(zhǔn)備Y軸纳决。

前面我們也交代過(guò)Y軸是p-value取log10碰逸，這時(shí)得到的是一個(gè)負(fù)值，我們?cè)侔阉兂烧麛?shù)所以乘以-1即：

log10_p_value = log10(volcano_plot$p_value) * -1

此時(shí)阔加，X,Y軸都準(zhǔn)備好了饵史，我們開(kāi)始作圖

plot(x=log2_foldchange,y=log10_p_value)

volcano plot 火山圖

這張圖雖然是火山圖的樣子了，但肯定是不符合paper的要求的胜榔，我們還需要對(duì)它進(jìn)行精修胳喷，至于怎么精修，明天講~

參考：
1.理論鋪墊部分：如何看懂火山圖
2.代碼部分：視頻里面的代碼
3.圖形部分：百度圖片