1. iTRAQ實(shí)驗(yàn)原理
iTRAQ（isobaric tags for relative and absolute quantitation先嬉，同位素標(biāo)記相對(duì)與絕對(duì)定量技術(shù)）技術(shù)是由ABI公司開發(fā)的一種體外標(biāo)記技術(shù)展父，采用4種或8種同位素的標(biāo)簽嫌松，可與氨基（包括氨基酸N端及賴氨酸側(cè)鏈氨基）反應(yīng)實(shí)現(xiàn)連接歧斟，再通過質(zhì)譜分析可同時(shí)對(duì)最多8種不同樣品中蛋白質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析[Ross PL, Huang YN, Marchese JN, et al. Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents. Mol Cell Proteomics, 2004, 3(12): 1154-69. Pierce A, Unwin RD, Evans CA闯团，et al. Eight-channel iTRAQ enables comparison of the activity of six leukemogenic tyrosine kinases. Mol Cell Proteomics, 2008, 7(5): 853-63]函匕。
iTRAQ試劑由三部分組成：報(bào)告基團(tuán)、平衡基團(tuán)和氨基反應(yīng)基團(tuán)耍目。在一級(jí)質(zhì)譜中膏斤，不同來源的相同肽段被連接上總質(zhì)量相同的完整iTRAQ標(biāo)簽試劑，具有相同質(zhì)荷比邪驮，表現(xiàn)為一個(gè)峰掸绞。在二級(jí)質(zhì)譜中，iTRAQ標(biāo)簽試劑在不同基團(tuán)連接處發(fā)生斷裂耕捞，試劑中報(bào)告基團(tuán)表現(xiàn)信號(hào)（平衡基團(tuán)發(fā)生中性丟失），根據(jù)不同報(bào)告基團(tuán)（四標(biāo)為114,115,116和117Da烫幕，八標(biāo)為113俺抽、114、115较曼、116磷斧、117、118捷犹、119和121 Da）信號(hào)峰強(qiáng)弱進(jìn)行肽段定量弛饭，并根據(jù)肽段二級(jí)質(zhì)譜信息實(shí)現(xiàn)肽段定性，并最終回溯到蛋白水平萍歉。
iTRAQ技術(shù)的優(yōu)勢(shì)：
通量高：可一次實(shí)現(xiàn)最多8次樣品的分離分析侣颂。
重復(fù)性好且定量準(zhǔn)確：所有樣品的分離鑒定條件完全一致，保證了實(shí)重復(fù)性枪孩，同時(shí)增強(qiáng)定量的準(zhǔn)確性憔晒。
分辨率高：可與最高分辨率的LC-MSMS技術(shù)結(jié)合藻肄，實(shí)現(xiàn)對(duì)低豐度蛋白的定量定性。
數(shù)據(jù)豐富：可以獲得檢測(cè)到的所有蛋白的定性和定量信息拒担。自動(dòng)化程度高：以高分辨率液質(zhì)聯(lián)用為基礎(chǔ)嘹屯，自動(dòng)化操作，分析速度快从撼。
2. iTRAQ操作流程圖
3. iTRAQ實(shí)驗(yàn)步驟
1）樣品制備?
a. 植物組織樣本
1. ?將冷凍的樣品取出州弟，加入液氮，充分研磨低零。
2. ?按照1：10的比例加入預(yù)冷的含10%TCA的丙酮婆翔，-20°C沉淀1小時(shí)。
3. ?4°C毁兆，15000g離心15min浙滤，取沉淀，加入預(yù)冷丙酮气堕，-20°C沉淀1小時(shí)纺腊。
4. ?重復(fù)以上步驟一次。
5. ?4°C茎芭，15000g離心15min揖膜，取沉淀，敞口放置5min左右至樣品干燥（植物等蛋白濃度比較低的樣品可以采用真空干燥器抽真空干燥5分鐘左右使樣品成干粉狀）梅桩。
6. ?將干燥后的沉淀加入酚抽提液混合至沉淀分散均勻壹粟。
7. ?加入等體積的酚-Tris-HCL(7.5)飽和溶液，4°C混合30分鐘宿百。
8. ?4°C趁仙，5000g離心30分鐘，收集酚上層垦页。
9. ?加入5倍體積的預(yù)冷0.1M醋酸銨-甲醇溶液雀费，-20°C沉淀1小時(shí)。
10.?4°C痊焊，10000g離心10分鐘盏袄，收集沉淀。
11. 加入5倍體積的預(yù)冷甲醇薄啥，輕微混合辕羽。
12. 4°C，10000g離心10分鐘垄惧，收集沉淀刁愿。
13. 以丙酮代替甲醇重復(fù)步驟11，12兩遍赘艳，充分去除甲醇酌毡。
14. 4°C克握，10000g離心10分鐘，收集沉淀枷踏。
15. 將干燥后的粉末溶解液于樣品裂解液中菩暗，30°C恒溫水浴充分溶解蛋白。
16. 將溶液在室溫下15000g離心15min旭蠕，取上清停团，并再次離心取上清，充分去除不容性雜質(zhì)掏熬。上清即為組織的總蛋白溶液佑稠，進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定并分裝后儲(chǔ)存于-80°C備用或直接用于iTRAQ分析。
b.動(dòng)物組織樣本
1. 將冷凍的樣品取出旗芬，直接加入適量裂解液舌胶，加入蛋白酶抑制劑（PMSF或Cocktail）使其終濃度為1mM，用移液器吹打至分散狀態(tài)疮丛。
2. 冰上超聲破碎幔嫂，功率80W，超聲0.8s誊薄，關(guān)閉0.8s履恩，共3min。
3. 加入5倍體積的預(yù)冷丙酮震蕩混合呢蔫，-20°C沉淀2小時(shí)或過夜切心。
4. 4°C，12000g離心10分鐘片吊，收集沉淀绽昏。
5. 加入適量體積的預(yù)冷丙酮震蕩混合，4°C俏脊，12000g離心15分鐘而涉，收集沉淀，重復(fù)該步驟一次联予。
6. 常溫下干燥后，溶解于樣品裂解液中材原，充分溶解蛋白沸久。
7. 將溶液在室溫下12000g離心15min，取上清余蟹，并再次離心取上清卷胯，充分去除不容性雜質(zhì)。
上清液即為組織的總蛋白溶液威酒，分裝后儲(chǔ)存于-80°C備用或直接用于iTRAQ分析窑睁。
2）蛋白定量
1.?按50體積BCA試劑A加1體積 BCA試劑 B(50:1)配制適量 BCA工作液挺峡，充分混勻。
2. 將0.5mg/mL蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液按0, 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20μL加到96孔板的標(biāo)準(zhǔn)品孔中担钮，加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液補(bǔ)足到20μL橱赠。
3. 加適量體積樣品到96孔板的樣品孔中，加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋補(bǔ)充到20μL箫津。
4. 各孔加入200μLBCA工作液狭姨，37°C放置20-30分鐘。
5. 使用紫外分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀測(cè)定A562吸光度苏遥，540-595nm之間的波長(zhǎng)也可接受饼拍，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品的蛋白濃度。
3）蛋白還原烷基化及酶解
參考FASP[Jacek R Wisniewski, Alexandre Zougman, Nagarjuna Nagaraj and Matthias MannUniversal.?Nature Methods, 2009,?6: 359 - 362]方法酶解蛋白田炭。
1. 蛋白定量后每個(gè)樣品各取100μg师抄，采用5倍體積預(yù)冷丙酮進(jìn)行沉淀，-20°C放置1小時(shí)教硫，充分沉淀蛋白叨吮。
2. 4°C，12,000rpm離心10分鐘栋豫，取沉淀真空冷凍干燥挤安。
3. 采用50μl iTRAQ 試劑盒中的Dissolution Buffer充分溶解蛋白沉淀，加入4 μl Reducing Reagent丧鸯，60°C反應(yīng)1小時(shí)蛤铜。
4. 加入 2μl Cysteine-Blocking Reagent，室溫反應(yīng)10分鐘丛肢，將還原烷基化后的蛋白溶液加入10K的超濾管中围肥，12,000 rpm離心20分鐘，棄掉收集管底部溶液蜂怎。
5. 加入100μl Dissolution Buffer穆刻，12,000 rpm離心20分鐘，棄掉收集管底部溶液杠步，重復(fù)3次氢伟。
6.更換新收集管，在超濾管中加入50μl濃度為50ng/μl的測(cè)序級(jí)胰蛋白酶溶液幽歼，37°C反應(yīng)12小時(shí)朵锣。
7. 12000rpm離心20分鐘，收集酶解后肽段甸私，在超濾管中再加入50μl Dissolution Buffer诚些，12000rpm離心20分鐘，收集管底溶液并與前次溶液合并皇型。
4）蛋白標(biāo)記
1.?將iTRAQ試劑平衡到室溫诬烹，離心至管底砸烦。
2. 用150μl 異丙醇溶解iTRAQ試劑。
3. 取50μl樣品（100μg酶解產(chǎn)物）轉(zhuǎn)移到新的離心管中绞吁，加入iTRAQ試劑后室溫反應(yīng)2小時(shí)幢痘。
4. 加入100μl水終止反應(yīng)。
5. 混合所有標(biāo)記樣品掀泳，渦旋振蕩雪隧，離心至管底；
6. 真空冷凍干燥樣品员舵，留作iTRAQ分離鑒定脑沿。
5）2D-LC-MS/MS分析
1.?冷凍干燥后的樣品用110μL 流動(dòng)相A 溶液溶解。
2. 肽段分離在Agilent 1200 HPLC上進(jìn)行马僻，檢測(cè)波長(zhǎng)：紫外210nm和280nm庄拇；流速：0.3ml/min，非線性二元梯度：
3.?0-5分鐘丟棄韭邓，6-45分鐘每4.5分鐘收集1管措近，46-50分鐘收集成1管，總共10管樣品溶液女淑，然后將每管溶液徹底冷凍干燥瞭郑。
4. 將陽離子交換分離后凍干的多肽樣品重新溶解于Nano-RPLC Buffer A中。
5. 在線Nano-RPLC液相色譜在Eksigent nanoLC-Ultra? 2D系統(tǒng)(AB SCIEX)進(jìn)行鸭你，溶解后的樣品以2μL/min的流速上樣到C18預(yù)柱上（100μm×3cm屈张，C18, 3μm, 150?），然后保持流速?zèng)_洗脫鹽10min袱巨。
6. 分析柱是C18反相色譜柱（75μm x 15 cm C18- 3μm 120 ?, ChromXP Eksigent）阁谆，實(shí)驗(yàn)所用梯度為70min內(nèi)流動(dòng)相B由5%升高至35%。
7. 質(zhì)譜采用TripleTOF5600系統(tǒng)(AB SCIEX)結(jié)合納升噴霧III離子源(AB SCIEX, USA)愉老，噴霧電壓為2.5 kV场绿，氣簾氣壓為30PSI，霧化氣壓為5PSI嫉入，加熱器溫度為150°C焰盗，質(zhì)譜掃描方式為信息依賴的采集工作模式下（IDA，Information Dependent Analysis）咒林，一級(jí)TOF-MS單張圖譜掃描時(shí)間為250ms姨谷，每次IDA循環(huán)下最多采集35個(gè)電荷為2+到5+且單秒計(jì)數(shù)大于150的二級(jí)圖譜，每次循環(huán)時(shí)間固定為2.5秒映九，碰撞室能量設(shè)定適用于所有前體離子碰撞誘導(dǎo)解離（CID），動(dòng)態(tài)排除設(shè)置為18秒瞎颗，約等于色譜半峰寬件甥。
