背景簡介
本文題為：Transcriptional diversity and bioenergetic shift in human breast cancer metastasis revealed by single-cell RNA sequencing，單細胞轉(zhuǎn)錄組揭示乳腺癌轉(zhuǎn)移能量代謝改變。發(fā)表于2020年3月罗心，主要涉及的背景知識為腫瘤轉(zhuǎn)移與腫瘤能量代謝。 腫瘤轉(zhuǎn)移是腫瘤死亡的主要因素尊流，主要過程為侵襲轉(zhuǎn)移級聯(lián)反應蔑祟，包括以下五個步驟（括號內(nèi)為涉及的相關機制）：
①原發(fā)腫瘤細胞向周圍組織局部侵襲。（EMT）
②腫瘤細胞進入血管榜贴，并在循環(huán)系統(tǒng)中生存矢赁。（CTC）
③腫瘤細胞局部停滯糯笙，出血管壁撩银，進入遠端組織實質(zhì)给涕。（TEM，跨內(nèi)皮遷移）
④在遠處實質(zhì)中形成微轉(zhuǎn)移克隆额获。（DTC）
⑤微轉(zhuǎn)移灶增殖至臨床可見。（定植抄邀，種子與土壤學說）
腫瘤能量代謝最著名的特點為Waburg效應耘眨，即在氧氣充足的情況下境肾，腫瘤細胞糖酵解增強剔难，氧化磷酸化被抑制，大量葡萄糖通過有氧糖酵解產(chǎn)生乳酸奥喻。腫瘤為何產(chǎn)生Waburg效應一直是腫瘤糖代謝的研究重點偶宫，主要有以下幾類假說：
① 腫瘤細胞通過糖酵解產(chǎn)生大量中間產(chǎn)物用于其他物質(zhì)代謝途徑环鲤，如氨基酸和核苷酸的合成纯趋，滿足腫瘤快速增殖的需要冷离。
② 無氧呼吸可以避免呼吸鏈產(chǎn)生大量氧自由基吵冒，從而避免細胞凋亡。
③ 無氧呼吸產(chǎn)生大量乳酸西剥，使局部pH降低痹栖，一方面通過促進基質(zhì)細胞凋亡促進腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移，另一方面通過馴化免疫細胞蔫耽，產(chǎn)生免疫抑制的環(huán)境留夜，幫助腫瘤免疫逃逸匙铡。
文獻鏈接：https://www.nature.com/articles/s41556-020-0477-0
摘要
雖然腫瘤轉(zhuǎn)移是腫瘤相關的主要死因，但其機制仍知之甚少鳖眼。在此黑毅，我們使用單細胞測序技術(shù)和人源異種移植乳腺癌模型钦讳，建立了一種穩(wěn)健的方法矿瘦，以識別播散期罕見轉(zhuǎn)移癌細胞轉(zhuǎn)錄組的全局改變。我們發(fā)現(xiàn)原發(fā)腫瘤和微轉(zhuǎn)移瘤均表現(xiàn)出轉(zhuǎn)錄異質(zhì)性缚去，但微轉(zhuǎn)移在病人源性異種移植模型中存在一個獨特的轉(zhuǎn)錄組程序，該程序可高度預測病人的不良生存琼开。通路分析顯示氧化磷酸化是微轉(zhuǎn)移瘤上調(diào)的top通路，而原發(fā)性乳腺癌則展現(xiàn)出糖酵解酶上調(diào)柜候。流式分析和代謝組分析證實了這一結(jié)果搞动。藥物抑制氧化磷酸化顯著減弱腫瘤轉(zhuǎn)移至肺渣刷，表明氧化磷酸化是在轉(zhuǎn)移中的功能重要性鹦肿，并強調(diào)其作為防止乳腺癌患者的轉(zhuǎn)移擴散治療靶點的潛力。
方法
①流式抗體：
人特異性抗體CD298 (diluted 1:100; PE; BioLegend, cat. no. 341704)
鼠特異性抗體MHC-I (diluted 1:150; APC; Thermo Fisher Scientific, cat. no. 17-5957-80)
細胞活力negative staining with SYTOX blue (diluted 1:1,000; Thermo Fisher Scientific, cat. no. S34857)
人類原發(fā)與轉(zhuǎn)移癌 gating on Sytox?CD298+MHC-I? cells.
線粒體膜電位讀數(shù)TMRM (diluted 1:500; Thermo Fisher Scientific, cat. no. T668), MitoTracker-Green (diluted 1:100 from a 10 μM stock; Thermo Fisher Scientific, cat. no. M7514), human-specific antibody CD298 (diluted 1:100; APC; BioLegend, cat. no. 341706) and the mouse-specific antibody MHC-I (diluted 1:100; PE/Cy7; BioLegend, cat. no. 114717).
寡霉素處理后細胞活力測定annexin V-FITC (diluted 1:100; GeneTex, cat. no. GTX14082) and propidium iodide (diluted 1:100; Thermo Fisher Scientific, cat. no. P3566).
②ScRNA-seq：
總共3個TNBC病人箩溃，9只人源異種移植小鼠，樣本來源于小鼠乳腺原發(fā)腫瘤碌嘀、淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移、肺微轉(zhuǎn)移
上游處理：SmartSeq2流程筏餐，測序平臺為HiSeq2500开泽，比對Bowtie 2魁瞪，定量RSEM穆律，定量結(jié)果為log2（TPM+1）导俘，載入Seurat峦耘。
細胞質(zhì)量控制：去除基因數(shù)少的細胞(<2,500 genes per cell)，去除線粒體含量高的細胞（>50%）
基因質(zhì)量控制：去除表達細胞量少的基因(<8 cells per gene)
批次效應矯正：利用Seurat中的RegressOut功能辅髓，我們使用nGene和percent. Mito當作協(xié)變量計算z-score殘差泣崩，進行主成分分析和tSNE分析。G1/S和G2/M評分采用下面描述的基因評分法計算矫付，針對樣本HCI001和HCI010進行回歸。
降維第焰、聚類、細胞識別挺举、差異表達杀赢、富集分析：Seurat v 2.1.0湘纵、Enrichr
③識別候選生物標志物用于logistic回歸建模：
對每一個基因z-score標準化脂崔。為了進行模型擬合，從每個小鼠和細胞類別(腫瘤與微轉(zhuǎn)移)中均等抽樣10次砌左，以避免系統(tǒng)偏差。對于每一次采樣伤柄，都進行了向前選擇的逐步回歸绊困，每一步都選擇最小化Akaike信息準則的模型作為下一步的基礎模型适刀。我們的邏輯回歸模型使用了基于Akaike信息標準圖中肘點的五個基因的保守閾值來最小化我們的基因集的大小秤朗，同時保持模型的描述能力笔喉。（即我們通常所說的AIC法）
④基因集分數(shù)：
基因集來自KEGG數(shù)據(jù)庫取视，打分使用Seurat的AddModuleScore()功能
⑤生存分析：
RFS，K-M曲線作谭，KM Plotter database，top20微轉(zhuǎn)移相關基因奄毡。其中2個基因無統(tǒng)計學差異，3個基因無對應探針吼过，其余15個基因計算平均值锐秦，閾值使用‘a(chǎn)uto select best cutoff ’
⑤其他
①耗氧速率oxygen-consumption rate (OCR)與細胞外酸化率extracellular acidification rate (ECAR)：海馬生物科學XF24細胞外通量分析儀(Agilent)
②熒光壽命成像fluorescence lifetime imaging (FLIM)：倒置激光掃描共聚焦顯微鏡盗忱；數(shù)據(jù)分析：SimFCS酱床，用于分析游離NADH和結(jié)合NADH含量。
③代謝組LC–HRMS扇谣，分析軟件MetaboAnlyst昧捷，https://www.metaboanalyst.ca/
④本文數(shù)據(jù)：GSE123837，同時提供GitHub代碼靡挥。
主要結(jié)果
圖一：單細胞轉(zhuǎn)錄組測序流程，此處圖D也驗證了上次推文單細胞轉(zhuǎn)錄組分析腫瘤異質(zhì)性的結(jié)論：病人間異質(zhì)性較大衩茸。同時還得出了新的結(jié)論：原發(fā)腫瘤細胞與微轉(zhuǎn)移腫瘤細胞間異質(zhì)性較小贮泞。從圖c的HE染色可以看出楞慈，微轉(zhuǎn)移腫瘤在肺中散在分布啃擦，呈現(xiàn)多克隆的感覺囊蓝。
隨后，針對三個樣本分別分析令蛉，以探索瘤內(nèi)異質(zhì)性。
此處針對樣本的細胞周期進行探索珠叔，發(fā)現(xiàn)1號和10號病人樣本聚類結(jié)果主要由細胞周期驅(qū)動（如中間的圖所示），因此矯正細胞周期批次效應祷安。此處數(shù)據(jù)處理非常細心姥芥，值得學習汇鞭，也可以類似地探索文庫大小凉唐、基因數(shù)目、線粒體比例等因素台囱。
圖二：降維聚類結(jié)果，微轉(zhuǎn)移癌與原發(fā)癌均分布于每一個cluster读整，表明微轉(zhuǎn)移癌與原發(fā)癌均具有瘤內(nèi)異質(zhì)性，其中A1米间、B1强品、C2车伞、C3微轉(zhuǎn)移癌比例較大择懂，具有細胞狀態(tài)的傾向性。
圖三：微轉(zhuǎn)移細胞表現(xiàn)出獨特的轉(zhuǎn)錄組特征另玖。
Tobit檢驗表伦，330個差異基因，P < 0.05, min.pct = 0.1, log[FC] threshold = 0.25
鑒定出多個之前未知與轉(zhuǎn)移相關的差異基因慷丽，如CKB, PHLDA2, NME1, ASHA1, NOP16 and S100A16，見圖c要糊，差異明顯纲熏。
識別與預后相關的基因锄俄，K-M plotter數(shù)據(jù)庫局劲，選擇basal-like breast cancer（879 patients）奶赠，前20個基因里有15個與較差預后相關鱼填。（閾值P < 0.05, hazard ratio (HR) ≥ 1.4;）綜合15個基因結(jié)果也有顯著差異。（圖d）
利用抽樣的方法針對330個基因構(gòu)建logistic模型苹丸，共計構(gòu)建10個模型，最終苇经，PHLDA2是微轉(zhuǎn)移細胞的首選候選，并且存在于10個模型中的8個模型扇单。該基因是一個母系印記基因商模，在體外調(diào)節(jié)胎盤生長令花，增加異種移植物的移植物定植和細胞侵襲阻桅，但與乳腺癌轉(zhuǎn)移的關系有限。
在原發(fā)腫瘤中該基因僅在少量細胞表達（圖三e）嫂沉，作者認為這些表達PHLDA2的細胞可能是轉(zhuǎn)移前細胞。這些結(jié)果強調(diào)了單細胞數(shù)據(jù)可以用于識別轉(zhuǎn)移性腫瘤的潛在驅(qū)動因素扮碧，預測乳腺癌患者轉(zhuǎn)移進展的生物標志物。
圖四：微轉(zhuǎn)移細胞展現(xiàn)出氧化磷酸化活性增高慎王。
圖a針對330個基因的GO富集結(jié)果蚓土，大多數(shù)微轉(zhuǎn)移通路富集于呼吸鏈赖淤、線粒體代謝蜀漆、OXPHOS等通路，表明氧化磷酸化在微轉(zhuǎn)移細胞中升高咱旱；而原發(fā)腫瘤富集于EMT确丢、糖酵解绷耍、ECM組織、血管生成等鲜侥，均為原發(fā)腫瘤的常見標志褂始。這份數(shù)據(jù)分析結(jié)果非常集中，這與作者之前細致的工作是密不可分的描函，因此我們在正式數(shù)據(jù)分析時崎苗，一定要檢查細胞周期、線粒體含量舀寓、基因數(shù)量等因素是否產(chǎn)生了明顯批次效應胆数。
流式結(jié)合代謝組驗證以上結(jié)果：微轉(zhuǎn)移細胞展現(xiàn)出氧化磷酸化活性增高。
TMRM流式分析可展示膜電位情況基公，如左圖幅慌，TMRM高宋欺，膜電位高轰豆，TMRM低，膜電位低齿诞。圖中顯示微轉(zhuǎn)移腫瘤細胞TMRM膜電位高酸休。
圖e下方qPCR檢查TMRM高低表達細胞線粒體生物氧化和呼吸鏈基因表達量，顯示表達量確實均升高祷杈。
圖五：（6個肺轉(zhuǎn)移與原發(fā)腫瘤配對樣本）此處為代謝組驗證斑司，結(jié)果發(fā)現(xiàn)微轉(zhuǎn)移細胞與原發(fā)腫瘤細胞存在整體代謝組差異。盡管由于轉(zhuǎn)移病灶的細胞數(shù)量有限但汞，較少的豐富代謝物低于檢測的限度宿刮，但對150個已識別的代謝物的分析表明，轉(zhuǎn)移細胞表現(xiàn)出獨特的代謝特征私蕾。
圖六：氧化磷酸化對于乳腺癌肺轉(zhuǎn)移至關重要僵缺。
使用復合體V抑制劑oligomycin寡霉素，使細胞糖代謝轉(zhuǎn)向糖酵解途徑踩叭，測量其對肺轉(zhuǎn)移的影響磕潮。由于寡霉素具有毒性，此處還測定了細胞的健康和代謝狀態(tài)容贝。主要結(jié)果為圖gh自脯。
之后還證明了寡霉素對于原發(fā)腫瘤生長無顯著影響，僅對轉(zhuǎn)移起作用斤富。
思考
本文通過分析人源異種移植小鼠原發(fā)腫瘤與微轉(zhuǎn)移腫瘤的單細胞測序數(shù)據(jù)膏潮，得出原發(fā)腫瘤中普遍存在的有氧糖酵解代謝特征，在轉(zhuǎn)移過程中丟失焕参，微轉(zhuǎn)移腫瘤重新獲得氧化磷酸化的能力屋谭。本文大部分工作均是單細胞轉(zhuǎn)錄組的常規(guī)分析龟糕，中途加入K-M plotter數(shù)據(jù)庫的生存數(shù)據(jù)桐磁，說明原發(fā)腫瘤與微轉(zhuǎn)移腫瘤細胞之間差異基因具有較強的臨床相關性讲岁，同時利用logistic回歸建模找到區(qū)分原發(fā)腫瘤與微轉(zhuǎn)移腫瘤細胞的關鍵基因我擂。
本文最終落腳點并非在基因水平缓艳，而是通路水平校摩，通過富集分析找到的通路非常集中阶淘，均為氧化磷酸化相關的通路衙吩，這與作者前期細致的預處理的密不可分的溪窒。
本文得出結(jié)論后的驗證工作也非常扎實坤塞，既有流式和代謝組驗證澈蚌，又有寡霉素抑制復合體V的基礎實驗驗證摹芙，多種方法驗證同一個結(jié)論讓作者研究結(jié)果非惩鹈椋可信浮禾。
總而言之份汗，本文得出重要結(jié)論的關鍵不在于生物信息分析方法的高大上，而在于細致的預處理杯活、分析結(jié)果的精準解讀與嚴謹準確的實驗驗證匆帚。
