6mA甲基化-DNA甲基化研究新熱點(diǎn)
原創(chuàng) 阿拉雷 基迪奧生物
表觀遺傳研究
我們常聽到這樣一種觀點(diǎn)：除了先天的基因遺傳外浦夷，所處的環(huán)境與過往的經(jīng)歷對人的塑造同樣重要糕殉。這個(gè)觀點(diǎn)生物學(xué)上的確存在證據(jù)，即在不發(fā)生DNA序列變化的前提下尚粘，基因功能發(fā)生可逆的變化贡翘。這種變化的常見的類型如：DNA甲基化、組蛋白修飾揪漩、染色體可及性變化等，統(tǒng)稱為表觀遺傳修飾吏口。而引發(fā)這些變化的原因奄容，很大部分是生命對所處環(huán)境變化做出的響應(yīng)。表觀層面變化引起性狀變化的現(xiàn)象十分普遍产徊，例如人老年性黃斑變性疾舶豪铡（AMD）的產(chǎn)生就是由于染色質(zhì)開放性變化引起的[1]，植物在干旱舟铜、高鹽環(huán)境中可通過自身RNA甲基化修飾的方式保持RNA穩(wěn)定戈盈，產(chǎn)生抗逆相關(guān)蛋白，以適應(yīng)在逆境中生長[2]谆刨。此外塘娶，動(dòng)物的毛色、植物的花色等性狀都和表觀遺傳息息相關(guān)痊夭。
DNA甲基化修飾
表觀遺傳研究中最受關(guān)注的莫過于DNA甲基化修飾刁岸，當(dāng)我們談DNA甲基化時(shí)，一般討論的是5mC類型的DNA甲基化（如圖1她我，經(jīng)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶催化胞嘧啶轉(zhuǎn)化為5-甲基胞嘧啶）难捌，包括：CG膝宁、CHH鸦难、CHG根吁，這種5mC類型甲基化修飾廣泛存在于真核生物的C堿基上，通過5mC修飾可以調(diào)控相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄合蔽、染色體的形態(tài)變化等過程击敌。近20年來，關(guān)于5mC修飾調(diào)控基因表達(dá)的機(jī)理被大量挖掘拴事、發(fā)表沃斤，對5mC修飾從一無所知到今天的習(xí)以為常，我們需要花更大的力氣才能找到與前人研究不完全重疊的方向刃宵。圖2 6mA甲基化修飾
基因組6mA修飾檢測技術(shù)
當(dāng)前6mA的研究技術(shù)可大致分為兩大類型：總量鑒定娩嚼、高通量測序。1.總量鑒定：即通過斑點(diǎn)雜交（Dot blot）榴都、質(zhì)譜-色譜聯(lián)用（LC-MS）等技術(shù)檢測樣品DNA中具有6mA甲基化修飾的A堿基占總A堿基的比值待锈，進(jìn)而推測樣本6mA修飾程度。2.高通量測序：又可以細(xì)分為兩類1）6mA-IP-seq（使用6mA抗體抓取帶有該修飾的DNA片段嘴高，進(jìn)行測序）為代表的區(qū)域鑒定手段竿音，可以將6mA修飾位置鎖定在幾十bp大小的范圍內(nèi)。2）三代測序（Pacbio拴驮、Nanopore平臺(tái)）為代表的單堿基鑒定方法春瞬，可以準(zhǔn)確檢測位點(diǎn)是否發(fā)生6mA修飾。Nanopore平臺(tái)測序基于納米孔的單分子實(shí)時(shí)電信號測序技術(shù)套啤，DNA 雙鏈在馬達(dá)蛋白的帶領(lǐng)下與鑲嵌在生物膜上的納米孔蛋白結(jié)合并解螺旋宽气，在生物膜兩側(cè)電壓差的作用下随常，DNA鏈以一定的速率通過納米孔通道蛋白，由于 DNA鏈上不同堿基化學(xué)性質(zhì)存在差異萄涯，所以當(dāng)單個(gè)堿基或 DNA 分子通過納米孔通道時(shí)绪氛，會(huì)引起不同電學(xué)信號的變化[6]。通過對這些信號進(jìn)行檢測及對應(yīng)涝影，即可計(jì)算獲得相應(yīng)堿基的類型枣察，完成序列的實(shí)時(shí)測定（如圖3）。圖3 Nanopore測序原理相比于Pacbio平臺(tái)的三代甲基化測序燃逻，Nanopore擁有著兩方面優(yōu)勢：1）單次基因組測序序目，既可以輸出位點(diǎn)6mA修飾數(shù)據(jù)，還能夠輸出5mC甲基化伯襟，可以獲得更全面的基因組甲基化數(shù)據(jù)猿涨。 2）相比于Pacbio要求100X測序深度的數(shù)據(jù)，Nanopore僅需30X測序深度即可獲得準(zhǔn)確的6mA甲基化修飾數(shù)據(jù)姆怪，客觀上節(jié)省了測序成本叛赚，讓更多研究者可以踏足這個(gè)領(lǐng)域的研究。
分析內(nèi)容
常規(guī)6mA分析與5mC的分析內(nèi)容相似片效，一般包括了：1）甲基化位點(diǎn)分布特征分析2）甲基化位點(diǎn)motif序列分析3）甲基化相關(guān)基因分析4）甲基化與轉(zhuǎn)錄組關(guān)聯(lián)分析红伦。通過這四方面分析，可以幫助我們快速挖掘出組間存在差異的甲基化位點(diǎn)淀衣，找到這些差異位點(diǎn)的分布特征昙读，并分析差異甲基化引起的下游相關(guān)基因的差異表達(dá)情況，找出它們的內(nèi)在關(guān)聯(lián)膨桥，進(jìn)而挖掘甲基化影響表型性狀的機(jī)制蛮浑。
小結(jié)
1）DNA甲基化是一種生物廣泛存在的表觀修飾，對生命過程有著重要的影響只嚣。2）相比于成熟的5mC研究沮稚，6mA研究當(dāng)前還處于起步階段，概念與技術(shù)都存在著相當(dāng)大的潛力册舞，有助于發(fā)表高水平期刊蕴掏。3）6mA三代測序平臺(tái)Nanopore擁有著精度高、研究面廣调鲸、價(jià)格門檻低盛杰、性價(jià)比高等優(yōu)勢。4）數(shù)據(jù)分析上藐石，6mA可以借鑒5mC的分析思路進(jìn)行開展即供，不需要過多的摸索過程，可以大幅度縮短數(shù)據(jù)分析周期于微。
