摘要
已有報道用特定的因子(OCT4瓜客、SOX2哥桥、C-MYC和KLF4)從不同的人原代細胞中誘導出多能干細胞澜沟。近幾十年來衣屏，人成纖維細胞被廣泛用作重編程研究的細胞來源。最初的IPSC生成方法使用需要將病毒DNA整合到靶細胞中的逆轉錄病毒或慢病毒載體楞黄。在IPSCs中可以檢測到編碼轉錄因子(OCT4趾诗、SOX2贮尖、cMYC和KLF4)的外源基因的整合呻待，這引起了人們對突變和腫瘤形成風險的擔憂打月。因此，理想的干細胞治療需要使用非整合性基因傳遞系統(tǒng)蚕捉，如仙臺病毒奏篙、重組蛋白、合成的mRNA和游離質粒來產(chǎn)生無整合的IPSCs迫淹。幾個研究小組已經(jīng)報道秘通，游離質粒能夠將人成纖維細胞重新編程為IPSCs。雖然載體濃度和細胞密度在外體載體重編程方法中很重要敛熬，但該方法在人成纖維細胞中的優(yōu)化尚未見報道充易。在這項研究中，我們通過使用不同濃度的游離型/附加型質粒載體(OCT4/P53荸型、SOX2/KLF4、L-MYC/Lin28a)和不同的平板細胞密度炸茧，確定了從人成纖維細胞中產(chǎn)生無整合IPSCs的最佳條件瑞妇。我們發(fā)現(xiàn)，優(yōu)化的載體濃度和細胞密度加速了重編程梭冠，并提高了IPSC的生成辕狰。我們的研究提供了一種詳細的循序漸進的方案，用于通過轉染游離質粒來改進從人成纖維細胞中產(chǎn)生無整合的IPSCs控漠。
背景
使用逆轉錄病毒或慢病毒載體表達重編程因子（OCT4蔓倍、SOX2、KLF4 和 C-MYC）誘導多能性在各種人類細胞類型中是成功的盐捷，包括成纖維細胞偶翅、尿源性細胞和外周血細胞（Takahashi 等人 2007 ；Staerk 等人 2010 年碉渡；Zhou 等人 2011 年）聚谁。最初，使用了基于病毒的方法滞诺，這些方法高效形导、直接、可靠且易于采用习霹。然而朵耕，這些方法需要整合到宿主基因組中的病毒載體，這可能導致基因突變和腫瘤形成淋叶，從而限制了此類細胞在治療應用中的使用阎曹。為了避免這些問題，已經(jīng)開發(fā)了幾種方法來生成無整合誘導多能干細胞 (iPSC)，例如 piggyBac 系統(tǒng)芬膝、小環(huán)載體望门、合成 mRNA、仙臺病毒锰霜、重組蛋白和游離型質粒載體 (Fusaki 等人 2009筹误；Kim 等人 2009；Woltjen 等人 2009癣缅；Yu 等人 2009厨剪；Jia 等人 2010；Okita 等人 2011）友存。
在無整合方法中祷膳，游離型質粒方法是一種技術上簡單、快速屡立、方便且可重復的生成 iPSC 的方法直晨。然而，與病毒載體相比膨俐，游離型載體的重編程效率較低（Okita et al 2010; Zhou and Zeng 2013）勇皇。此外，在許多使用游離型系統(tǒng)的研究中焚刺，轉錄因子是通過核轉染單獨傳遞的敛摘。然而，由于核轉染載體攝取的差異乳愉，每個細胞的基因表達水平是高度可變的（Drozd et al 2015）兄淫。
在這項研究中，我們使用逐步協(xié)議優(yōu)化了人類包皮成纖維細胞（BJ 細胞）重編程為附加型 iPSC（Epi-iPSC）蔓姚，該協(xié)議使用優(yōu)化的載體濃度和細胞接種密度捕虽。我們相信本研究中描述的結果可用于涉及 Epi-iPSCs 生成的其他實驗。
材料和方法
細胞培養(yǎng)
BJ 細胞從 ATCC 獲得并在小鼠胚胎成纖維細胞 (MEF) 培養(yǎng)基中培養(yǎng)坡脐，該培養(yǎng)基由補充有 10% 胎牛血清 (FBS; Corning)薯鳍、0.1 mM 非必需氨基酸的 Dulbecco's Modified Eagle's Media (DMEM; Welgene) (NEAA; Gibco) 和 1% 青霉素/鏈霉素 (P/S; Welgene)。將人類胚胎干細胞 (hESCs) 和 iPSCs 接種到涂有 Matrigel (Corning) 的培養(yǎng)皿上挨措，并在 mTeSR 培養(yǎng)基 (Stemcell Technology) 中培養(yǎng)挖滤。游離型載體
游離型載體 pCLXE-hOCT4/p53、pCLXE-hSOX2/KLF4浅役、pCLXE-hL-MYC/LIN28A 最初由 (Okita et al 2011) 描述斩松，并從 Addgene (Cat 27078赃承、Cat 27080 和貓 27077疙教，分別）糯耍。轉染率分析
Amaxa 4D-Nucleofector 試劑盒針對 P2 原代細胞溶液 (Lonza) 的優(yōu)化用于根據(jù)制造商的說明用 pmaxGFP 對照載體 (Lonza) 轉染 BJ 細胞。對于每次轉染涂臣，1.5 × 106 個細胞在室溫下以 13,000 rpm 的速度離心 4 分鐘戳气，然后重新懸浮在 82 μl 的 P2 原代細胞溶液和 18 μl 補充劑 1 中怨愤⌒诱埃混合 pmaxGFP 對照載體（0–21 μg）與 BJ 細胞的細胞懸液，并轉移到 Nucleocuvette Vessel 中嫡霞。使用帶有 4D-Nucleofector (Lonza) 的程序設置 DT-130 轉染 BJ 細胞瓶埋，鋪在涂有基質膠的 6 孔培養(yǎng)皿上，并在 MEF 培養(yǎng)基中培養(yǎng)以監(jiān)測 4 周內的 GFP 表達诊沪。流式細胞術分析
GFP 陽性細胞用 0.25% 胰蛋白酶 (Gibco) 解離养筒，用 Dulbecco 磷酸鹽緩沖液 (HyClone; DPBS) 洗滌，并用 DPBS 重懸端姚。使用 BD Accuri C6 流式細胞儀 (BD Biosciences) 進行熒光激活細胞分選 (FACS) 分析 4 周晕粪。使用 FlowJo 軟件 9.1 版（Tree Star）分析 FACS 數(shù)據(jù)。用于產(chǎn)生 iPSC 的游離型載體濃度優(yōu)化
BJ 細胞 (1.5 × 106) 通過用 0.25% 胰蛋白酶處理分離渐裸，并根據(jù)制造商的說明巫湘，使用用于 P2 原代細胞溶液的 Amaxa 4D-Nucleofector 試劑盒用 pmaxGFP 對照載體電穿孔。將三種游離型載體（0-21 μg）中的每一種與 82 μl P2 原代細胞溶液和 18 μl 補充劑 1 混合昏鹃。將轉染的 BJ 細胞接種到 MEF 培養(yǎng)基中涂有基質膠的 6 孔培養(yǎng)皿上剩膘。轉染 2 天后，去除 MEF 培養(yǎng)基并用 TeSR-E7 培養(yǎng)基（干細胞技術）替換盆顾。每天更換培養(yǎng)基。在轉染后 10-14 天內畏梆，Epi-iPSCs 擴大到適合轉移的大小您宪。在轉移之前，將 10 μMY-27632 (Selleckchem) 添加到 mTeSR 培養(yǎng)基中奠涌。使用 10 μl 移液器吸頭將菌落轉移到涂有基質膠的 4 孔培養(yǎng)皿上宪巨。為生成 iPSC 優(yōu)化初始鋪板細胞數(shù)
為了生成 Epi-iPSC，根據(jù)制造商的說明溜畅，使用用于 P2 原代細胞溶液的 Amaxa 4D-Nucleofector 試劑盒轉染 1.5 × 106 BJ 細胞捏卓。游離型載體（各 3 μg：OCT4/p53、SOX2/KLF4慈格、L-MYC/LIN28A）與 82 μl P2 原代細胞溶液和 18 μl 補充 1 混合怠晴。將 BJ 細胞和游離型載體的混合物轉移到一個 Nucleocuvette Vessel 并以 DT-130 作為程序名稱進行電穿孔。將轉染的 BJ 細胞（每個載體總共 9 μg）接種到涂有基質膠的 6 孔培養(yǎng)皿（1.0 × 104浴捆、2.0 × 104蒜田、3.0 × 104、4.0 × 104选泻、5.0 × 104冲粤、1.0 × 105美莫、2.0 × 105 和3.0 × 105 個細胞）在 MEF 培養(yǎng)基中。轉染 2 天后梯捕，去除 MEF 培養(yǎng)基并用 TeSR-E7 培養(yǎng)基代替厢呵。每天更換培養(yǎng)基。在轉染后 10-14 天內傀顾，Epi-iPSCs 擴大到適合轉移的大小襟铭。轉移前，將 10 μMY-27632 添加到 mTeSR 培養(yǎng)基中锣笨。使用 10 μl 移液器吸頭將菌落轉移到涂有基質膠的 4 孔培養(yǎng)皿上蝌矛。RT-PCR 和定量
PCR 根據(jù)制造商的說明，使用 RNeasy Kit (Qiagen) 分離總 RNA错英。根據(jù)制造商的說明入撒，使用高容量 cDNA 逆轉錄試劑盒 (Applied Biosystems) 將總 RNA (1 μg) 逆轉錄為 cDNA。根據(jù)制造商的說明椭岩，使用 Ex Taq 聚合酶 (TaKaRa) 進行 RT-PCR茅逮。在 LightCycler 1536 實時 PCR 系統(tǒng) (Roche) 上使用 TaqMan PCR Master Mix (Thermo Scientific) 和 SYBR Green (Enzynomics) 進行 ANIMAL CELLS AND SYSTEMS 133 定量 PCR (qPCR)。所有值均標準化為內源性 GAPDH 對照判哥。堿性磷酸酶染色和免疫細胞化學
根據(jù)制造商的說明献雅，使用白細胞堿性磷酸酶試劑盒（Stemgent）進行堿性磷酸酶染色。對于免疫細胞化學塌计，用 DPBS 洗滌細胞并在室溫下在 4% 多聚甲醛中固定 15 分鐘挺身。固定的細胞在室溫下用 DPBS 中的 0.5% Triton X-100 (Sigma-Aldrich) 透化 10 分鐘，然后用 DPBS 中的 2% 稀釋的牛血清白蛋白 (Sigma-Aldrich) 封閉锌仅。然后將細胞在初級抗體溶液中于 4°C 孵育過夜章钾。用 DPBS 洗滌后，將細胞在二抗中室溫孵育 1 小時热芹。基因組 DNA 分離和亞硫酸氫鹽測序
為了確定 Epi-iPSC 的 DNA 甲基化狀態(tài)贱傀，使用 G-spin 總 DNA 提取試劑盒 (iNtRON) 分離基因組 DNA。根據(jù)制造商的說明伊脓，使用 EpiTect Bisulfite Kit (Qiagen) 修飾基因組 DNA (1 μg)府寒。通過PCR擴增人OCT4基因的啟動子區(qū)域。使用 QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen) 純化擴增產(chǎn)物并亞克隆到 TA 克隆載體 (Invitrogen) 中报腔。使用 M13 正向引物對單個克隆進行測序株搔。使用 QUMA（甲基化分析量化工具；http://quma.cdb.riken.jp/）對數(shù)據(jù)進行可視化和對齊纯蛾。Epi-iPSCs 的分化
通過將 EpiiPSCs 鋪板到 60 mm2 細菌級培養(yǎng)皿中來產(chǎn)生胚胎體 (EBs)邪狞。由大約 2.0 × 106 個細胞組成的 EB 在 mTeSR 培養(yǎng)基中。5 天后茅撞，將 EB 轉移到新的 60 mm2 細菌級培養(yǎng)皿中帆卓，并在 MEF 培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng) 14 天巨朦。為了分化為內胚層，將 EB 接種到內胚層分化培養(yǎng)基中涂有基質膠的 4 孔培養(yǎng)皿上剑令，該培養(yǎng)基由補充有 2% FBS糊啡、100 ng/μl 激活素 A (PeproTech)、1% L-谷氨酰胺 (Gibco) 的 RPMI 1640 (Gibco) 組成) 和 1% P/S吁津，為期 3 周棚蓄。為了分化成外胚層，將 EB 接種到外胚層分化培養(yǎng)基中涂有基質膠的 4 孔培養(yǎng)皿上碍脏，該培養(yǎng)基由 DMEM/F12（康寧）和 1 ml N-2 補充劑梭依、10 ng/ml 堿性成纖維細胞生長因子（PeproTech）組成， 2 μM SB431524 (Tocris)典尾、100 ng/μl Noggin (PeproTech)役拴、1% L-谷氨酰胺和 1% P/S，持續(xù) 3 周钾埂。為了分化成中胚層河闰，將 EB 接種到涂有基質膠的 4 孔培養(yǎng)皿中，該培養(yǎng)基由補充有 20% FBS褥紫、100 μM 抗壞血酸（Sigma-Aldrich）姜性、1% NEAA、1% L-的 KnockOut DMEM (Gibco) 組成髓考。谷氨酰胺和 1% P/S 3 周部念。游離體拷貝數(shù)測定
轉染后，將BJ細胞培養(yǎng)指定天數(shù)（BJ細胞-D5氨菇、Epi-iPSCs（P1）儡炼、Epi-iPSCs（P15）、BJ細胞）门驾，并提取基因組DNA。為了確定每個細胞的載體拷貝數(shù)多柑，使用連續(xù)稀釋的載體和基因組 DNA 來生成標準曲線奶是。每個 Epi-iPSCs 樣品中 EBNA-1 和 FBXO15 的拷貝數(shù)是使用 qPCR 和質粒特異性引物從觀察到的閾值循環(huán) (Ct) 值確定的。全轉錄表達陣列
根據(jù)制造商的說明竣灌，使用 RNeasy 柱 (Qiagen) 從 hESC聂沙、Epi-iPSC 和陰性對照 BJ 細胞制備總 RNA 樣品。Affymetrix Whole-Transcript Expression Array 處理是根據(jù)制造商的方案使用 GeneChip Whole Transcript PLUS 試劑盒進行的初嘹。如制造商所述及汉，使用 GeneChip WT (Whole Transcript) 擴增試劑盒合成 cDNA。然后使用 GeneChip WT 末端標記試劑盒將有義 cDNA 片段化并用 TdT（末端脫氧核苷酸轉移酶）標記生物素屯烦。大約 5.5 μg 標記的 DNA 靶標在 45°C 下與 Affymetrix GeneChip Human 2.0 ST Array 雜交 16 小時坷随。雜交陣列在 GeneChip Fluidics Station 450 上洗滌和染色房铭，并在 GCS3000 掃描儀 (Affymetrix) 上掃描。使用 Affymetrix GeneChip 命令控制臺軟件 (AGCC) 在 Affymetrix 數(shù)據(jù)提取協(xié)議中自動提取原始數(shù)據(jù)温眉。畸胎瘤形成
Epi-iPSCs (2.0 × 106) 與含有 Matrigel 的 mTeSR 混合并皮下注射到免疫缺陷小鼠的背外側缸匪。注射后 8 周，解剖腫瘤并在 4% 多聚甲醛中固定类溢。將石蠟包埋的組織切片并用蘇木精和伊紅 (Sigma-Aldrich) 染色凌蔬。
結果
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人成纖維細胞中 GFP 質粒轉染的優(yōu)化
為了優(yōu)化用于轉染的載體量，我們用不同數(shù)量的編碼 GFP 的游離型載體轉染 1.0 × 105 BJ 細胞闯冷，并在熒光顯微鏡下監(jiān)測 4 周內的 GFP 表達砂心。圖1）。對于轉染率的定量分析蛇耀，我們使用流式細胞儀分析了 GFP 表達辩诞。我們發(fā)現(xiàn)，當用最低量的載體 (3 μg) 轉染細胞時蒂窒，轉染后 1 周 GFP 在 16.4% 的細胞中表達躁倒。 GFP 陽性細胞的數(shù)量呈劑量依賴性增加；在用最高量的載體 (21 μg) 轉染的 86.4% 的細胞中檢測到 GFP 表達洒琢。我們的結果表明秧秉，增加附加型載體的數(shù)量可以改善轉染效率（圖 1）。然而衰抑，我們發(fā)現(xiàn)細胞死亡的發(fā)生也以劑量依賴性方式增加（數(shù)據(jù)未顯示）象迎。因此，選擇 21 μg 作為優(yōu)化 iPSC 生成的三個附加型載體的最大量呛踊。
用于人成纖維細胞重編程的每種載體的劑量優(yōu)化
我們優(yōu)化了使用游離型載體轉染 BJ 細胞的方法（圖 2(A)）砾淌。 2 周后，我們觀察到第一個 Epi-iPSC 簇谭网，顯示出典型的 iPSC 樣形態(tài)汪厨，我們計算了轉染不同量質粒（0-21 μg；圖）的細胞形成的堿性磷酸酶陽性菌落板數(shù)2(B))愉择。我們發(fā)現(xiàn)劫乱，與其他載體量相比，使用三種載體的混合物（每個載體 3 μg锥涕；總共 9 μg）顯著提高了重編程效率（圖 2(C)）衷戈。然后，我們從每組中挑選 iPSC 樣菌落层坠，并在 mTeSR 培養(yǎng)基中擴增 EpiiPSCs 20 代（數(shù)據(jù)未顯示）殖妇。
用 0 或 3 μg 游離型載體轉染的 BJ 細胞沒有顯示出 iPSC 樣菌落，表明這兩種濃度不足以在這種情況下誘導重編程破花。我們進一步研究了用于 BJ 細胞重編程的附加型載體的最佳濃度谦趣。雖然 9 μg 的轉染效率最高疲吸，但增加到 12-21 μg 會顯著降低重編程效率（約 50%；圖 2(C)）蔚润。
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Epi-iPSCs 的表征
我們檢查了 iPSC 樣菌落是否具有 hESCs 的典型形態(tài)磅氨、分子和功能特性。 RT-PCR 分析顯示 iPSC 樣細胞中激活典型的多能性基因（OCT4嫡纠、SOX2烦租、NANOG、REX1除盏、DPPA2 和 DPPA4）（圖 3(A)）叉橱。為了以高分辨率評估 Epi-iPSC 的重編程狀態(tài)，我們使用微陣列分析了它們的全局基因表達譜者蠕。熱圖分析表明窃祝，Epi-iPSCs 與 hESCs 緊密聚集在一起，但與 BJ 細胞明顯分離踱侣。具體而言粪小，與 BJ 細胞相比，已知參與多能性的基因如 OCT4抡句、SOX2探膊、NANOG 和 LIN28A 在 Epi-iPSC 和 hESC 中均上調。相反待榔，與 BJ 細胞相比逞壁，通常在成纖維細胞中表達的基因，如 COL3A1锐锣、DKK1 和 IL1R1腌闯，在 Epi-iPSC 和 hESC 中均被下調（圖 3（B））。流式細胞儀分析顯示雕憔，Epi-iPSCs 與 hESCs 聚集在一起姿骏，但與 BJ 細胞明顯不同（圖 3(C)）。我們還檢查了蛋白質水平上多能性的誘導斤彼。通過免疫染色確定分瘦，多能性標記 OCT4、SOX2畅卓、NANOG擅腰、SSEA4蟋恬、TRA-1-60 和 TRA1-81 在 Epi-iPSC 和 hESC 中均表達（圖 3(D)）翁潘。我們檢查了多能性標記 OCT4 的 DNA 甲基化狀態(tài)。值得注意的是歼争，OCT4 的啟動子區(qū)域在 Epi-iPSC 中未甲基化拜马，與對照 hESC 中的水平相似（圖 3（E））渗勘。最后，我們評估了Epi-iPSCs 通過在體外誘導其分化為內胚層俩莽、外胚層和中胚層的分化能力旺坠。 RT-PCR 證實了三個胚層標記基因在 Epi-iPSCs 和分化細胞中的表達。 GAPDH 用作陽性對照 (圖 3(F))扮超。免疫細胞化學分析證實 Epi-iPSCs 表達內胚層標志物 AFP取刃、中胚層 NKX2.5 和外胚層 MAP2（圖 3(G)）。為了研究 Epi-iPSCs 的體內分化能力出刷，我們將它們皮下移植到 NOD/SCID 小鼠中璧疗。 8 周后，我們觀察到包含三個胚層馁龟、內胚層崩侠、中胚層和外胚層組織的畸胎瘤形成（圖 3（H））
- Epi-iPSC 生成的細胞密度依賴性重編程
在 iPSC 生成過程中通常出現(xiàn)的另一個技術障礙是用于轉染的電穿孔引起的細胞死亡。為了克服由細胞死亡引起的重編程失敗却音，我們從以不同細胞密度鋪板并用 3 μg 每種載體轉染的 BJ 細胞生成 Epi-iPSC。在轉染后約 2 周觀察到最初的 Epi-iPSC 簇（數(shù)據(jù)未顯示）矢炼。 6 孔培養(yǎng)皿中每孔 1.0 × 105 個細胞的密度對于生成 EpiiPSC 最有效（圖 4）系瓢。總之裸删，我們的數(shù)據(jù)表明八拱，為了實現(xiàn)高效的 BJ 細胞重編程，編碼 OCT4/P53涯塔、SOX2/KLF4 和 L-MYC/LIN28A 的三種附加型載體的最佳濃度為 3 μg肌稻，細胞密度為1.0 × 105。
