前言

關(guān)于clusterProfiler這個R包就不介紹了，網(wǎng)紅教授宣傳得很成功滥酥，功能也比較強大剩岳，主要是做GO和KEGG的功能富集及其可視化。簡單總結(jié)下用法仇矾，以后用時可直接找來用庸蔼。

首先考慮一個問題：clusterProfiler做GO和KEGG富集分析的注釋信息來自哪里？

GO的注釋信息來自Bioconductor贮匕，提供了19個物種的org類型的GO注釋信息姐仅，如下表所示。Bioconductor中更多的注釋包可參考http://www.bioconductor.org/packages/release/data/annotation/刻盐，很亂掏膏，大多數(shù)我都不知道干啥用的。

KEGG的注釋信息clusterProfiler通過KEGG 數(shù)據(jù)庫的API來獲取敦锌，https://www.kegg.jp/kegg/rest/keggapi.html馒疹。

首先是一個物種所有基因?qū)?yīng)的pathway注釋文件，比如人的：http://rest.kegg.jp/link/hsa/pathway供屉。
其次還需要pathway對應(yīng)的描述信息行冰，比如人的：
http://rest.kegg.jp/list/pathway/hsa。

關(guān)于KEGG數(shù)據(jù)庫全部的物種及其簡寫（三個字母）如下列表：
https://www.genome.jp/kegg/catalog/org_list.html伶丐。

因此對于以上已有pathway注釋的物種悼做，只需要將物種簡寫輸入給clusterProfiler， 它會通過聯(lián)網(wǎng)自動獲取該物種的pathway注釋信息哗魂。

以上都是有物種信息的情況肛走，那么對于無物種信息的項目怎么辦？

GO可以通過讀取外部的GO注釋文件進行分析录别。關(guān)于基因的GO注釋朽色，interproscan、eggnog-mapper和blas2go等軟件都可以做组题，不過輸出格式有些不同葫男。clusterProfiler需要導(dǎo)入的GO注釋文件的格式如下：

需要包含以上三列信息，這3列信息任意順序都可崔列。

clusterProfiler包只針對含有OrgDb對象梢褐，如果是公共數(shù)據(jù)庫中有該物種注釋信息旺遮，只是未制作成org.db數(shù)據(jù)庫（標(biāo)準(zhǔn)注釋庫），則可以不需要從頭注釋盈咳，只需手動制作org.db數(shù)據(jù)庫類型耿眉，完成后直接使用即可，代碼如下：

source("https://bioconductor.org/biocLite.R")
if (!requireNamespace("BiocManager", quietly = TRUE))
  install.packages("BiocManager")

BiocManager::install("AnnotationHub") # 一個包含大量注釋信息的數(shù)據(jù)庫鱼响，里面有很多物種及來源于很多數(shù)據(jù)庫的注釋信息鸣剪。
BiocManager::install("biomaRt")

library(AnnotationHub) 
library(biomaRt)

hub <- AnnotationHub() #建立AnnotationHub對象（視人品，網(wǎng)不行加載不了）
# unique(hub$species) #查看AnonotationHub里面物種
hub$species[which(hub$species=="Solanum")] #看AnonotationHub里是否包含想要的物種
# Solanum是番茄的拉丁名
query(hub, "Solanum")  #查看該物種信息
hub[hub$species=="Solanum" & hub$rdataclass == "OrgDb"] #OrgDb屬于rdataclass中丈积，因此查看下該物種有沒有OrgDb
Solanum.OrgDb <- hub[["AH59087"]]#AH59087是番茄對應(yīng)的編號
#制作為標(biāo)準(zhǔn)注釋庫筐骇，就可和模式生物一樣使用了

同樣地，對于pathway數(shù)據(jù)庫中沒有的物種江滨，也支持讀取基因的pathway注釋文件拥褂，然后進行分析，注釋文件的格式如下：

以上三列信息的順序也是任意的牙寞。

富集分析

通常用的富集分析有ORA、FCS和拓?fù)淙N方法莫秆。ORA簡單來說就是超幾何檢驗或Fisher精確檢驗间雀，大同小異，都符合超幾何檢驗镊屎，這也是目前用的最多的方法惹挟，優(yōu)劣不談。FCS的代表就是GSEA缝驳，即基因集富集分析连锯，優(yōu)劣亦不談。clusterProfiler提供了這兩種富集分析方法用狱。
1. ORA（Over-Representation Analysis）
GO富集參考代碼：

#標(biāo)準(zhǔn)富集分析
ego <- enrichGO(
          gene  = gene$entrzID,
          keyType = "ENTREZID", 
          universe = names(geneList), #背景基因集运怖，可省
          OrgDb   = org.Hs.eg.db,
          ont     = "CC",
          pAdjustMethod = "BH",
          pvalueCutoff  = 0.01,
          qvalueCutoff  = 0.05,
          readable      = TRUE)

#通過導(dǎo)入外部注釋文件富集分析
data <- read.table("go_annotation.txt",header = T,sep = "\t")
go2gene <- data[, c(2, 1)]
go2name <- data[, c(2, 3)]
x <- enricher(gene,TERM2GENE = go2gene,TERM2NAME = go2name)

gene差異基因?qū)?yīng)的向量;
keyType指定基因ID的類型，默認(rèn)為ENTREZID, 可參考keytypes(org.Hs.eg.db)類型 夏伊；
OrgDb指定該物種對應(yīng)的org包的名字摇展；
ont代表GO的3大類別，BP, CC, MF溺忧，也可是全部ALL咏连；
pAdjustMethod指定多重假設(shè)檢驗矯正的方法，有“ holm”, “hochberg”, “hommel”, “bonferroni”, “BH”, “BY”, “fdr”, “none”中的一種鲁森；
cufoff指定對應(yīng)的閾值祟滴；
readable=TRUE代表將基因ID轉(zhuǎn)換為gene symbol。

KEGG Pathway富集參考代碼：

#標(biāo)準(zhǔn)富集分析
ego <- enrichKEGG(
          gene = gene,
          keyType = "kegg",
          organism  = 'hsa',
          pvalueCutoff  = 0.05,
          pAdjustMethod  = "BH",
          qvalueCutoff  = 0.05
)


#通過外部導(dǎo)入注釋文件富集
data <- read.table("pathway_annotation.txt",header = T,sep = "\t")
go2gene <- data[, c(2, 1)]
go2name <- data[, c(2, 3)]
x <- enricher(gene,TERM2GENE = go2gene,TERM2NAME = go2name)

默認(rèn)基因ID為kegg gene id歌溉，也可以是ncbi-geneid, ncbi-proteinid, uniprot等垄懂。
organism物種對應(yīng)的三字母縮寫，其他參數(shù)同GO富集。ID轉(zhuǎn)換函數(shù)：

library(clusterProfiler)
bitr_kegg("1",fromType = "kegg",toType = 'ncbi-proteinid',organism='hsa')

library(org.Hs.eg.db)
keytypes(org.Hs.eg.db) #支持的ID類型
bitr(gene, fromType = "ENTREZID", toType = c("ENSEMBL", "SYMBOL"), OrgDb = org.Hs.eg.db)

#以上看出ID轉(zhuǎn)換輸入時埠偿，可以向量的形式透罢，也可以單列基因名list導(dǎo)入，也可以是內(nèi)置數(shù)據(jù)
gene <- c("AASDH","ABCB11","ADAM12","ADAMTS16","ADAMTS18")
gene  <-  data$V1 #字符串

data(geneList, package="DOSE") #富集分析的背景基因集
gene <- names(geneList)[abs(geneList) > 2]

2. GSEA（Gene Set Enrichment Analysis）
GO富集參考代碼：

#標(biāo)準(zhǔn)富集分析
ego <- gseGO(
      geneList  = geneList,
      OrgDb  = org.Hs.eg.db,
      ont  = "CC",
      nPerm  = 1000,  #置換檢驗的置換次數(shù)
      minGSSize  = 100,
      maxGSSize  = 500,
      pvalueCutoff = 0.05,
      verbose  = FALSE)

#通過導(dǎo)入外部注釋文件富集分析參考代碼：
data <- read.table("go_annotation.txt",header = T,sep = "\t")
go2gene <- data[, c(2, 1)]
go2name <- data[, c(2, 3)]
x <- GSEA(gene,TERM2GENE = go2gene,TERM2NAME = go2name)

KEGG Pathway富集參考代碼：

#標(biāo)準(zhǔn)富集分析
kk <- gseKEGG(
  geneList  = gene,
  keyType  = 'kegg',
  organism = 'hsa',
  nPerm  = 1000,
  minGSSize = 10,
  maxGSSize = 500,
  pvalueCutoff = 0.05,
  pAdjustMethod     = "BH"
)

#通過外部導(dǎo)入注釋文件富集
data <- read.table("pathway_annotation.txt",header = T,sep = "\t")
go2gene <- data[, c(2, 1)]
go2name <- data[, c(2, 3)]
x <- GSEA(gene,TERM2GENE = go2gene,TERM2NAME = go2name)

可視化

1.GO富集分析結(jié)果可視化

#barplot
barplot(ego, showCategory = 10) #默認(rèn)展示顯著富集的top10個冠蒋，即p.adjust最小的10個

#dotplot
dotplot(ego, showCategory = 10)

#DAG有向無環(huán)圖
plotGOgraph(ego)  #矩形代表富集到的top10個GO terms, 顏色從黃色過濾到紅色羽圃，對應(yīng)p值從大到小。

#igraph布局的DAG
goplot(ego)

#GO terms關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖（通過差異基因關(guān)聯(lián)）
emapplot(ego, showCategory = 30)

#GO term與差異基因關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖
cnetplot(ego, showCategory = 5)

2.Pathway富集分析結(jié)果可視化

#barplot
barplot(kk, showCategory = 10)

#dotplot
dotplot(kk, showCategory = 10)

#pathway關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖（通過差異基因關(guān)聯(lián)）
emapplot(kk,  showCategory = 30)

#pathway與差異基因關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖
cnetplot(kk, showCategory = 5)

#pathway映射
browseKEGG(kk, "hsa04934") #在pathway通路圖上標(biāo)記富集到的基因抖剿，會鏈接到KEGG官網(wǎng)

Ref：
https://blog.csdn.net/weixin_43569478/article/details/83744242
https://blog.csdn.net/weixin_43569478/article/details/83744384
http://www.reibang.com/p/065d38c28e2d
http://www.reibang.com/p/47b5ea646932
https://www.cnblogs.com/yatouhetademao/p/8018252.html
https://zhuanlan.zhihu.com/p/35510434