?一、污水中病毒組
最近在看一些病毒宏基因組的論文贤斜。前幾篇可能看得認(rèn)真和全面一點(diǎn)，寫得也會多猴抹，后面的論文方法什么的應(yīng)該大同小異草讶，就只總結(jié)流程圖和“小異”。
1.大致內(nèi)容流程圖
2.方法和結(jié)果
（1）viral particles：收集的污水樣品保存在-80℃坤溃。使用前薪介，600-800ml污水樣品在4℃解凍72h→4℃汁政，4000g缀旁，15min離心（留上清）→4℃，10000g并巍，15min離心（留上清）→采用0.22μm孔徑的切向流過濾（tangential-flow filtration）裝置收集病毒組分→用30-kDa的切向流過濾器濃縮病毒溶液至12ml→鏡檢（SYBR gold epifluorescence microscopy）懊渡。
（2）Viral nucleic acid：鏡檢有病毒粒子→采用超高速離心加蔗糖層（38%，wt/vol）的方法得到病毒沉淀→重懸在500μl SM buffer（100mMNaCl誓禁，8mMMgSO4·7H2O肾档，50mMTris-HCl，pH 7.5）中→用DNase和RNase消化游離的核酸→最后用試劑盒提取病毒的核酸戒祠。
（3）construct libraries：文中每個樣品都用了12對random primers做了RT和cDNA RT-PCR→樣品不同的PCR產(chǎn)物定量至相同的量→454 GS FLX titanium平臺測序。
（4）Bioinformatics：根據(jù)引物tags對得到的reads進(jìn)行修剪和解析低千，對于每個樣品馏颂，若reads間有超過35bp且一致性超過95%的救拉，會被assembled到同一個contigs→大于100bp的reads瘫拣、assembled contigs和nonassembled singlets在GenBank-nonredundant nucleotide and protein sequence databases中進(jìn)行比對（BLASTn和BLASTx），E value<10^-4→根據(jù)BLAST返回的結(jié)果將序列分類→解析序列與BLAST返回結(jié)果的一致性分布（sequence identity distribution analysis派昧，下圖）拢切。
四個樣品包含的病毒種類和占比
一致性分布五慈，每個點(diǎn)是一個BLAST中的查詢序列
（5）Acquisition of novel virus genomes：用試劑盒提取病毒粒子的核酸→病毒基因組序列的3’和5’端用RACE試劑盒擴(kuò)增，中間序列根據(jù)454的測序結(jié)果設(shè)計引物泻拦，用sanger測序驗(yàn)證忽媒。
對于環(huán)狀DNA基因組，使用“rolling-circle+inverse PCR amplification”陆错，我在前面的推送里寫過inverse PCR：【現(xiàn)學(xué)現(xiàn)賣】實(shí)驗(yàn)-PCR金赦。首先用試劑盒rolling- circle amplification（Genomiphi; GE Healthcare）和random hexamers擴(kuò)增核酸樣品中的環(huán)狀DNA基因組→用inverse PCR擴(kuò)增全長夹抗，sanger測序。
（6）Phylogenetic analysis：選取可能的新病毒和它們在BLAST中相近的hits杏愤，以及與相近科已脓、屬病毒的氨基酸序列→MUSCLE和MAFFT進(jìn)行多序列比對，選取比對好的進(jìn)行→pairwise distance analyses和conserved amino acid analyses厕宗，之后進(jìn)行→Maximum likelihood tree（RAxML預(yù)測參數(shù)，PROTGAMMA曲聂，Dayhoff similarity matrix parameters佑惠，用MEGA-midpoint rooting美化了無根樹）和Sliding-window analyses。
圖片中A是兩個新病毒旭咽，B和C是用序列中兩個片段分別建樹的結(jié)果轻专。
有的新病毒和已知病毒的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)
與其他病毒親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的病毒请垛，B是sliding-window分析的aa序列一致性
（7）Nucleotide composition analysis?(NCA)：判斷新發(fā)現(xiàn)的病毒的宿主宗收。因?yàn)檫@個是研究生活污水的混稽，所以要看病毒群體和新病毒的寄主是什么审胚。
文章結(jié)構(gòu)清晰，結(jié)果討論部分充分分析了材料中包含的已知病毒種類和寄主的分布情況洽洁，以及實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)的新病毒的可能種類和可能寄主菲嘴，并且結(jié)合NCA結(jié)果，討論進(jìn)化樹中分支的可能原因等昭雌。
