1. 流式細胞術(shù)：是基于細胞或顆粒光學散射特點和熒光信號差異對單個細胞或顆粒進行統(tǒng)計分析的一種檢測方法竹捉。
2. 流式抗體：與普通抗體的不同捷兰，是偶聯(lián)熒光素的抗體.
表達某一抗原的細胞與偶聯(lián)熒光素的抗體特異性結(jié)合谬俄，經(jīng)過流式細胞儀檢測區(qū)時熒光素被激光激發(fā)椎镣，發(fā)射出的熒光信號被接收冗美。
分析時反推回去：某種熒光信號→某種流式抗體→某種抗原→某種細胞。
3. 流式圖：流式儀將接收到的光信號轉(zhuǎn)化為電信號掸屡，經(jīng)計算機轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號封寞，繪制成圖呈現(xiàn)。
一仅财、流式圖解析
1. 單參數(shù)直方圖
2. 雙參數(shù)散點圖
3. 等高線圖和密度圖
流式數(shù)據(jù)分析的過程實際上就是在流式圖上選門和設(shè)門的過程狈究。
設(shè)門：是指用門選擇某一或某些特性的細胞，是定性細胞亞群的重要方法盏求《蹲叮可以是單一門，可以使邏輯門碎罚。
門：可以是任意形狀磅废，可以封閉，可以開放（十字門）荆烈。門是人為設(shè)定的區(qū)域拯勉，有主觀性，所以要設(shè)置對照使更客觀憔购。
設(shè)門需要考慮的因素——對照的設(shè)置
1). 必須有不染色的細胞作為空白對照
2). 抗原抗體的結(jié)合是否是特異性結(jié)合
a. 用同型對照判斷是否存在非特異性結(jié)合
b. 用Fc block阻斷細胞上的Fc受體非特異結(jié)合流式抗體
c. 用死活染料排除死細胞的干擾
3). 用陽性對照檢驗染色方案是否可行
4). 不同熒光素重疊光譜之間的補償宫峦，單染管對照，F(xiàn)MO對照玫鸟。
1. 單參數(shù)直方圖
a.橫坐標代表熒光信號或散射光信號相對強度导绷，可以是線性或?qū)?shù)坐標。
b.縱坐標一般是相對細胞數(shù)鞋邑。
下圖中诵次，細胞樣品染CD3 FITC抗體為例，通過橫坐標的熒光強度枚碗，把此細胞樣品分為兩群逾一，左邊一群是CD3 negative，右邊一群是CD3 positive肮雨，進而我們可以知道此細胞樣品中CD3陽性細胞的比例是多少遵堵。
下圖是單參數(shù)直方圖的應(yīng)用：
分群情況（下圖）：
第一張圖是：空白不染的細胞的檢測圖，
第二張圖是：一個樣本管，
第三張圖是：有兩個尖尖的峰頂陌宿，
第四張圖是：很明顯的兩個峰锡足，
其中，第三張和第四張畫門正確壳坪，第二張圖畫門不正確舶得，不能畫門，不能用百分比爽蝴，應(yīng)該用MFI值表示陽性群沐批，因為圖二中群體比較均一。MFI中的M在大多數(shù)情況下是指mean值平均熒光強度蝎亚。
mean,median,mode,Geom mean的區(qū)別：
mean是平均熒光強度九孩，其缺點是：如果在當下視野里，細胞群體過大或過小发框，mean重復呈現(xiàn)性就會比較差躺彬。如果細胞群體都在視野里，可以用mean值梅惯。
median是熒光強度的中位數(shù)宪拥。100個細胞中50和51取個平均值。
mode是眾數(shù)铣减，是一組數(shù)據(jù)中出現(xiàn)次數(shù)最多的數(shù)量江解。峰頂對應(yīng)的熒光強度即眾數(shù)。
Geom mean是幾何平均數(shù)徙歼，是指n個觀察值連乘積的n次方根。
如果不是正態(tài)分布時鳖枕，可以用Geom mean.
這四個值中魄梯，mean和Geom mean都可以代表整個細胞群的情況。mediun和mode只代表單一細胞的熒光強度宾符。
選擇用哪個值酿秸，是根據(jù)流式圖的分布。在標準的高斯分布情況下魏烫，median=mean=mode辣苏，通常在流式中因為總會有異常值（超高或超低值）的存在，不是完美的高斯分布哄褒，建議使用medium稀蟋，降低異常值對數(shù)據(jù)的影響。
2. 雙參數(shù)散點圖
散點圖比直方圖提供更多的信息呐赡。
等高線圖比散點圖更易分群退客。
橫坐標和縱坐標都是光信號，十字門左下角是雙陰性群，右下角和左上角是單陽群萌狂，右上角是雙陽群档玻。散點圖上的每一個點可以代表某一個細胞的信息。
3. 等高線圖和密度圖（略）
4. 比較
二茫藏、補償調(diào)節(jié)
1.熒光素補償來源
a. adjacent detectors相鄰通道的補償：FITC和PE兩通道互相逸漏误趴。
b. residual base fluorescence偶聯(lián)素相互之間的補償
c. similar emission spectra（cross-laser）不同激光器激發(fā)，但是因為光斑的影響务傲，也會逸漏濾光片相鄰的兩個通道凉当。
2. FITC compensation
先上未染色的細胞作為空白對照，以調(diào)節(jié)各個熒光通道的電壓树灶；
然后單染管上樣纤怒，比如上樣FITC單染管，發(fā)現(xiàn)細胞群會飄到PE和percp-cy5.5通道里天通，會出現(xiàn)在雙陽區(qū)域Q2泊窘。
調(diào)節(jié)補償?shù)脑瓌t：上誰的單染管就減去誰的通道里的光。
調(diào)完以后（下圖）像寒，細胞群只落到了FITC單陽區(qū)烘豹。
調(diào)補長需要注意：
1. 同質(zhì)性：不同細胞自發(fā)熒光強度不同
2. 陰性群：必須要有陰性群體
3. 陽性群：陽性群數(shù)量不一定要很多，但是陰陽群體一定要分得開诺祸。
未完待續(xù)
