第二十一章：毛細(xì)管電泳法
毛細(xì)管電泳法CE/HPCE：以高壓直流電為驅(qū)動(dòng)力缝驳，毛細(xì)管為分離通道根據(jù)樣品各組分的電泳和分配行為差異而實(shí)現(xiàn)分離的一類分析技術(shù)辕漂。由于毛細(xì)管散熱效率高，可以應(yīng)用更高電壓
特點(diǎn)：操作簡單、分離效率高品嚣、樣品用量少压昼、運(yùn)行成本低
缺點(diǎn)：遷移時(shí)間重現(xiàn)性求冷、進(jìn)樣準(zhǔn)確性、檢測靈敏度低于HPLC窍霞，不適于制備性分離
第一節(jié)：毛細(xì)管電泳基礎(chǔ)理論
電滲和電滲率
電滲：液體相對于帶電管壁移動(dòng)的現(xiàn)象
Zeta電勢：在電場作用下匠题，固液兩相的相對運(yùn)動(dòng)發(fā)生在緊密層和擴(kuò)散層之間的滑動(dòng)面上，此處的電動(dòng)電勢即為Zeta電勢百科解釋：Zeta電位是連續(xù)相與附著在分散粒子上的流體穩(wěn)定層之間的電勢差
電滲流EOF：由于離子是溶劑化的但金，當(dāng)擴(kuò)散層的離子在電場中發(fā)生遷移時(shí)韭山，將攜帶溶劑一起移動(dòng)，形成電滲流
,
是電滲淌度冷溃，
是介電常數(shù)钱磅，
是黏度
在普通毛細(xì)管電泳條件下，電滲流從正極流向負(fù)極似枕。Zeta電勢越大盖淡、雙電層越薄、電荷密度越大凿歼、粘度越小褪迟，電滲流越大。一般電滲流速度是電泳速度5~7倍
- 石英毛細(xì)管表面硅羥基離解隨pH升高而增大答憔，引起界面有效電荷密度增大味赃，電滲流增大
- 當(dāng)溶液中含有陽離子表面活性劑時(shí)，陽離子表面活性劑通過強(qiáng)的靜電作用吸附在毛細(xì)管壁上虐拓，減小了界面有效電荷密度心俗，甚至使內(nèi)壁帶相反電荷，使電滲流減小或反轉(zhuǎn)
- 在緩沖溶液中加有機(jī)溶劑（甲醇蓉驹、乙腈）城榛，能抑制電滲流
電泳和電泳淌度
電泳是在電場作用下，帶電粒子在緩沖溶液中定向移動(dòng)的現(xiàn)象
戒幔，V為毛細(xì)管兩端電壓吠谢，L為毛細(xì)管總長度
對于一個(gè)離子淌度可近似為：，
為離子的Zeta電位诗茎，表面電荷越大工坊，質(zhì)量越小献汗，Zeta電勢越大
在實(shí)際溶液中離子活度系數(shù)、溶質(zhì)分子的離解程度均對離子的淌度有影響王污，用表示
表觀淌度
粒子在毛細(xì)管內(nèi)運(yùn)動(dòng)速度是兩種速度矢量和稱為表觀淌度用表示
分離效率和譜帶展寬
理論塔板數(shù)和塔板高度
罢吃，
，tm為流出曲線最高點(diǎn)所對應(yīng)的時(shí)間稱為遷移時(shí)間昭齐，Ld為有效長度（進(jìn)樣端到檢測端的距離）
毛細(xì)管電泳法分離柱效方程：
增大電壓尿招，增大Ld/L可以提高柱效，大分子物質(zhì)擴(kuò)散系數(shù)小阱驾，所以分離效果好就谜，毛細(xì)管電泳法特別適用于生物大分子
引起譜帶展寬的因素
電滲流驅(qū)動(dòng)下扁平流
- 擴(kuò)散：縱向擴(kuò)散是譜代展寬的唯一因素，
里覆，凡是影響擴(kuò)散的因素都影響譜帶寬度
- 焦耳熱：焦耳熱通過管內(nèi)壁向周圍環(huán)境中擴(kuò)散時(shí)丧荐，早毛細(xì)管內(nèi)形成拋物線型徑向溫度梯度，徑向溫度梯度影響溶液黏度產(chǎn)生粒子遷移速度的徑向不均勻喧枷，導(dǎo)致區(qū)帶展寬虹统。通過增大內(nèi)外徑之差增加散熱面積，降低緩沖液濃度降低焦耳熱影響
- 吸附：指毛細(xì)管壁對被分離物質(zhì)粒子的作用隧甚。陽離子溶質(zhì)和帶負(fù)電的毛細(xì)管壁靜電作用车荔，疏水作用。細(xì)內(nèi)徑毛細(xì)管不利于降低吸附戚扳，生物大分子分析時(shí)常需要用內(nèi)壁涂層處理的毛細(xì)管柱
分離度
影響因素：
- 外加電壓
- 有效柱長和總長度之比
- 電泳有效淌度差
- 電滲淌度
第二節(jié)：毛細(xì)管電泳法主要分離模式
毛細(xì)管電泳法分類
按填充物質(zhì)性狀：自由溶液忧便、非自由溶液
按分離機(jī)制：電泳、色譜帽借、電泳/色譜
除凝膠電泳法和電色譜法需用填充型分離柱外其余幾種僅是基于使用的運(yùn)行緩沖溶液（BGE）不同
毛細(xì)管凝膠電泳法（CGE）茬腿、毛細(xì)管等電聚焦法（CIEF）、毛細(xì)管等速電泳法（CETP）主要用于生物大分子
藥物分析常用毛細(xì)管區(qū)帶電泳CZE和膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜法MECC
毛細(xì)管區(qū)帶電泳法
- 分離機(jī)制：依據(jù)電泳淌度分離宜雀，正離子先出，中線分子無法分離握础，帶相同電荷離子按荷質(zhì)比分離
- 實(shí)驗(yàn)條件選擇：
- 分離電壓：隨電壓變化分離效率存在極大值辐董，分離效率極大時(shí)的電壓稱為最佳工作電壓。
- 緩沖溶液種類：在所選pH范圍有足夠大緩沖容量禀综；與檢測器相匹配简烘；自身淌度低，分子大而荷電卸稀孤澎；使被測組分帶合適電荷量；盡可能采用酸性pH條件減少吸附和電滲欠窒；與毛細(xì)管種類匹配覆旭；使用高純水配置
- 緩沖溶液濃度：隨濃度增加，離子強(qiáng)度增大，溶質(zhì)和管壁間型将，被分離組分間相互作用降低寂祥，電滲率降低，遷移速度降低七兜，焦耳熱增加
- 緩沖溶液pH：酸性組分在堿性丸凭，堿性組分選酸性，兩性都可選腕铸；糖類9~11惜犀，羧酸類5~9；隨pH增大狠裹，電滲增大
- 添加劑：無機(jī)電解質(zhì)可壓縮取代虽界，抑制蛋白質(zhì)吸附，但是增加焦耳熱酪耳；高分子類添加劑可以形成分子團(tuán)或特殊局部結(jié)構(gòu)浓恳，影響遷移過程；甲醇碗暗、乙腈可抑制電滲流
膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜法
膠束電動(dòng)色譜法MEKC：是以膠束為假固定相的一種電動(dòng)色譜法颈将。又稱膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜法（MECC）
可以分離CZE中無法分離的中性化合物
- 膠束假固定相：
- 陽離子表面活性劑吸附在石英毛細(xì)管上，可減慢電滲流速度或使電滲流轉(zhuǎn)向言疗，稱之為EOF改性劑
- 組成一個(gè)膠束的分子數(shù)叫聚集數(shù)（n）
- 分離機(jī)制：中性溶質(zhì)在隨電滲流移動(dòng)的過程中晴圾，在水相和膠束相之間進(jìn)行分配，基于其與膠束作用強(qiáng)弱差異噪奄，在兩相間分配系數(shù)不同而得到分離
- 流動(dòng)相：改變膠束（種類和濃度）和緩沖體系（種類和濃度）會(huì)改變?nèi)苜|(zhì)分配系數(shù)死姚，進(jìn)而對容量因子和遷移產(chǎn)生影響。pH影響MECC中帶電組分遷移速度和電滲速度勤篮，但不影響SDS荷電狀況都毒；向緩沖溶液中加有機(jī)溶劑會(huì)改變水溶液極性，條件分配系數(shù)碰缔，提高分離選擇性
毛細(xì)管電色譜法
毛細(xì)管電色譜法CEC：是在毛細(xì)管內(nèi)填充账劲、內(nèi)壁涂覆、鍵合或交聯(lián)色譜固定相金抡，以電滲流驅(qū)動(dòng)流動(dòng)相完成分離的微柱色譜技術(shù)
分離機(jī)制：被測組分根據(jù)它們在流動(dòng)相和固定相中的分配系數(shù)不同和自身電泳淌度差異得以分離
-
分離條件選擇：首先固定相瀑焦，其次流動(dòng)相和緩沖液。根據(jù)固定相和流動(dòng)相性質(zhì)梗肝，CEC可分為反相榛瓮、正相、離子交換和分子交換巫击。使用的色譜柱有填充柱禀晓、開管柱精续、整體柱
緩沖液可以是水溶液或有機(jī)溶液。pH對溶質(zhì)的保留影響很大匆绣，在pKa附件調(diào)節(jié)pH易于獲得較高選擇性驻右。為煎炒焦耳熱，流動(dòng)相通常采用低濃度緩沖溶液崎淳。
常規(guī)條件無法改善分離時(shí)堪夭，可以考慮加壓毛細(xì)管色譜（P-CEC）或混合固定相填充CEC柱
氣泡陳勝時(shí)導(dǎo)致分離失敗的主要原因，一般出現(xiàn)在樣品塞子與填料交界處拣凹。采用P-CEC可以避免氣泡產(chǎn)生森爽，縮短分離時(shí)間
第三節(jié)：毛細(xì)管電泳儀
包括高壓電源、電解液槽和進(jìn)樣系統(tǒng)嚣镜、毛細(xì)管及其溫控系統(tǒng)爬迟、檢測器、記錄數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)
高壓電源
防止高壓放電：干燥菊匿、隔離付呕、降低分離電壓
毛細(xì)管柱
常用彈性熔融石英毛細(xì)管。
對于從未使用過的未涂漬柱跌捆，使用前用5~15倍柱體積NaOH徽职，水，及3~5倍柱體積運(yùn)行緩沖溶液沖洗（平衡毛細(xì)管）佩厚，或增加有機(jī)溶劑如甲醇清洗步驟姆钉。更換緩沖溶液也需要用運(yùn)行緩沖溶液平衡。
對于蛋白質(zhì)等需要對毛細(xì)管比進(jìn)行改性處理（物理涂覆抄瓦、化學(xué)鍵和潮瓶、交聯(lián)）
進(jìn)樣系統(tǒng)
采用無死體積進(jìn)樣方式，進(jìn)樣系統(tǒng)包括動(dòng)力控制钙姊、壓力控制毯辅、計(jì)時(shí)控制、電極槽或毛細(xì)管移位控制
- 壓力進(jìn)樣：填充介質(zhì)有流動(dòng)性煞额，選擇性差（組分和基質(zhì)都同時(shí)被引進(jìn)管中）
- 電動(dòng)進(jìn)樣：對填充介質(zhì)無要求悉罕，基質(zhì)影響小，對離子組分存在進(jìn)樣偏向立镶，基質(zhì)變化影響重現(xiàn)性
- 擴(kuò)散進(jìn)樣：對介質(zhì)無要求，擴(kuò)散具有雙向性（抑制背景干擾）类早，無進(jìn)樣偏向
常用壓力進(jìn)樣
檢測器
柱上檢測（毛細(xì)管出口端除去不透明保護(hù)層）：紫外媚媒、熒光
柱后檢測：電化學(xué)、質(zhì)譜
激光誘導(dǎo)熒光（LIF）：常用氬離子激光器
