詳細(xì)內(nèi)容：
開門見山
www.scRNA-tools.org：專門收集scRNA-seq分析的工具
使用scRNA-tools數(shù)據(jù)庫探索單細(xì)胞RNA-seq分析領(lǐng)域
Exploring the single-cell RNA-seq analysis landscape with the scRNA-tools database
雜志：plos computational biology
時間：收稿日期： 2017年12月6日; 接受日期： 2018年5月30日; 發(fā)布時間： 2018年6月25日
作者：盧克扎皮亞
角色 概念化，形式分析，調(diào)查，方法論鹃共，軟件吨述，寫作 - 原始草稿纸镊，寫作 - 審查和編輯
隸屬于 生物信息學(xué)，默多克兒童研究所突那，墨爾本侨颈，維多利亞余赢，澳大利亞，墨爾本大學(xué)肛搬，墨爾本没佑，維多利亞毕贼，澳大利亞科學(xué)學(xué)院生物科學(xué)學(xué)院
http://orcid.org/0000-0001-7744-8565
貝琳達(dá)皮森
角色 監(jiān)督温赔，寫作 - 審查和編輯
隸屬 生物信息學(xué)，默多克兒童研究所鬼癣，墨爾本陶贼，維多利亞州，澳大利亞
http://orcid.org/0000-0002-1711-7454
艾麗西亞奧什拉克
角色 監(jiān)督待秃，寫作 - 審查和編輯
*電子郵件： alicia.oshlack@mcri.edu.au
隸屬于 生物信息學(xué)拜秧，默多克兒童研究所，墨爾本章郁，維多利亞枉氮，澳大利亞，墨爾本大學(xué)暖庄，墨爾本聊替，維多利亞，澳大利亞科學(xué)學(xué)院生物科學(xué)學(xué)院
[TOC]
摘要
? 隨著單細(xì)胞RNA測序（scRNA-seq）數(shù)據(jù)集的普及培廓，用于分析這些數(shù)據(jù)的工具數(shù)量急劇增加∪乔模現(xiàn)在可用的大量工具導(dǎo)航對于研究人員來說變得越來越具有挑戰(zhàn)性。為了更好地選擇合適的分析工具肩钠，我們創(chuàng)建了scRNA-tools數(shù)據(jù)庫（www.scRNA-tools.org）在分析工具可用時對其進(jìn)行分類和輔助分析泣港。我們的數(shù)據(jù)庫收集有關(guān)每個scRNA-seq分析工具的一系列信息暂殖，并根據(jù)他們執(zhí)行的分析任務(wù)對其進(jìn)行分類。對該數(shù)據(jù)庫的探索提供了對scRNA-seq數(shù)據(jù)分析方法快速發(fā)展領(lǐng)域的見解当纱。我們看到許多工具執(zhí)行特定于scRNA-seq分析的任務(wù)呛每，特別是細(xì)胞的聚類和排序。我們還發(fā)現(xiàn)scRNA-seq社區(qū)采用開源和開放科學(xué)的方法坡氯，大多數(shù)工具在開源許可下可用莉给，且被廣泛用作描述方法的手段。scRNA-tools數(shù)據(jù)庫為開展scRNA-seq分析的研究人員提供了寶貴的資源廉沮，并隨時間記錄了該領(lǐng)域的成長颓遏。
作者摘要
? 近年來，出現(xiàn)了單細(xì)胞RNA測序技術(shù)滞时，使科學(xué)家能夠同時測量數(shù)千個細(xì)胞中基因的活性叁幢。這意味著我們可以開始查看樣本中每個cell正在做什么，而不是考慮樣本中所有cell的平均值坪稽，就像舊技術(shù)的情況一樣曼玩。然而，雖然訪問這類數(shù)據(jù)提供了大量機(jī)會窒百，但它帶來了一系列新挑戰(zhàn)黍判。世界各地的研究人員已經(jīng)開發(fā)出新的方法和軟件工具來充分利用這些數(shù)據(jù)集，但該領(lǐng)域正在以如此快的速度發(fā)展篙梢，很難跟上目前可用的數(shù)據(jù)顷帖。為了使這更容易，我們開發(fā)了scRNA-tools數(shù)據(jù)庫和網(wǎng)站（www.scRNA-tools.org）渤滞。我們的數(shù)據(jù)庫目錄分析工具贬墩，記錄它們可以用于的任務(wù)，可以從哪里下載以及描述它們?nèi)绾喂ぷ鞯某霭嫖锿弧Ｍㄟ^查看此數(shù)據(jù)庫陶舞，我們可以看到開發(fā)人員專注于特定于單細(xì)胞數(shù)據(jù)的方法，并且他們采用開源方法绪励，允許許可肿孵，共享代碼和發(fā)布預(yù)打印出版物
可以用于的任務(wù)，可以從哪里下載以及描述它們?nèi)绾喂ぷ鞯某霭嫖?# 還有引用情況的排序高低疏魏，包含但不限于R停做、python、C++
介紹
? 單細(xì)胞RNA測序（scRNA-seq）作為在單個細(xì)胞的分辨率下詢問轉(zhuǎn)錄組的有效工具已迅速獲得牽引力蠢护。自第一個方案于2009年發(fā)表[ 1 ] 以來雅宾，個體scRNA-seq實驗中分析的細(xì)胞數(shù)量呈指數(shù)增長，超過了摩爾定律[ 2 ]。這種新的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)需要新的分析方法眉抬。scRNA-seq數(shù)據(jù)集的規(guī)模不僅比大量實驗的規(guī)模大得多贯吓，而且單細(xì)胞環(huán)境也存在各種獨特的挑戰(zhàn)[ 3]]。具體來說蜀变，scRNA-seq數(shù)據(jù)極其稀疏（在大多數(shù)細(xì)胞中沒有測量許多基因的表達(dá)）悄谐，它可能具有技術(shù)假象，例如低質(zhì)量細(xì)胞或測序批次之間的差異库北，并且感興趣的科學(xué)問題通常不同于那些詢問批量RNA-seq數(shù)據(jù)集爬舰。例如，通過設(shè)計的實驗產(chǎn)生許多大量RNA-seq數(shù)據(jù)集以發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)的基因寒瓦，而許多scRNA-seq實驗旨在鑒定或分類復(fù)雜組織中的細(xì)胞類型情屹。
2009年單細(xì)胞技術(shù)開始問世？杂腰！
在大多數(shù)細(xì)胞中沒有測量許多基因的表達(dá)）垃你，它可能具有技術(shù)假象，例如低質(zhì)量細(xì)胞或測序批次之間的差異
# 低質(zhì)量細(xì)胞喂很，或者測序得到基因個數(shù)比較的cell惜颇，會在后續(xù)的過濾中，有一點過濾少辣。
# 理論支持分析技術(shù)
# 單細(xì)胞技術(shù)應(yīng)用：
鑒定或分類復(fù)雜組織中的細(xì)胞類型
? 生物信息學(xué)界以驚人的速度接受了這種新型數(shù)據(jù)凌摄，設(shè)計了大量的scRNA-seq數(shù)據(jù)分析方法。跟上scRNA-seq分析的當(dāng)前狀態(tài)現(xiàn)在是一項重大挑戰(zhàn)漓帅，因為該領(lǐng)域提供了大量用于分析數(shù)據(jù)集的選擇锨亏。自2016年9月起，我們對scRNA-seq分析工具進(jìn)行了整理和分類煎殷。該數(shù)據(jù)庫正在不斷更新屯伞，可在www.scRNA-tools.org上公開獲取。為了幫助研究人員駕馭分析工具的廣闊海洋豪直，我們在scRNA-seq分析的典型階段的背景下對數(shù)據(jù)庫中的工具進(jìn)行分類。通過對該數(shù)據(jù)庫的分析珠移，我們不僅展示了這些方法所解決的分析應(yīng)用程序的趨勢弓乙，還展示了它們?nèi)绾伟l(fā)布和許可，以及它們使用的平臺钧惧。<u>基于該數(shù)據(jù)庫暇韧，我們深入了解了這個快速發(fā)展的領(lǐng)域當(dāng)前工具的現(xiàn)狀</u>。
設(shè)計和實施
數(shù)據(jù)庫
? scRNA-tools數(shù)據(jù)庫包含專門用于分析scRNA-seq數(shù)據(jù)的軟件工具的信息浓瞪。要使某個工具有資格包含在數(shù)據(jù)庫中懈玻，它<u>必須可供下載和公共使用</u>。這可以來自軟件包存儲庫（例如Bioconductor [ 4]乾颁，CRAN或PyPI）涂乌，代碼共享網(wǎng)站艺栈，如GitHub或直接來自私人網(wǎng)站。當(dāng)我們注意到新工具時湾盒，它們會被添加到scRNA-tools數(shù)據(jù)庫中湿右。記錄任何相關(guān)出版物的DOI和出版日期。由于預(yù)印本可能經(jīng)常更新罚勾，因此它們被標(biāo)記為預(yù)印本而不是記錄日期毅人。還記錄了用于構(gòu)建工具的平臺，代碼存儲庫的鏈接尖殃，相關(guān)許可證和簡短描述丈莺。每個工具都根據(jù)它可以執(zhí)行的分析任務(wù)進(jìn)行分類，根據(jù)隨附的文章或文檔中的描述送丰，為每個類別接收真或假场刑。我們還記錄了每個條目添加到數(shù)據(jù)庫的日期以及上次更新的日期。https://github.com/seandavi/awesome-single-cell）蚪战。
網(wǎng)站
? 為了構(gòu)建網(wǎng)站牵现，我們從上面描述的表開始，作為使用R腳本處理的CSV文件邀桑。將下載CRAN瞎疼，Bioconductor，PyPI和Anaconda軟件存儲庫中可用的軟件包列表壁畸，并與數(shù)據(jù)庫中的工具進(jìn)行匹配贼急。對于具有相關(guān)出版物的工具，使用rcrossref軟件包（v0.8.0）[ 5 ] 從Crossref數(shù)據(jù)庫（www.crossref.org）檢索他們收到的引用次數(shù)捏萍。我們還使用aRxiv包（v0.5.16）[ 6 ]來檢索有關(guān)arXiv預(yù)印本的信息太抓。生成描述完整表，工具和類別的JSON文件令杈，并用于填充網(wǎng)站走敌。
# R包
rcrossref軟件包（v0.8.0）檢索Crossref數(shù)據(jù)庫（[www.crossref.org](http://www.crossref.org/)）檢索他們收到的引用次數(shù)
aRxiv包（v0.5.16）
? 該網(wǎng)站由三個主頁組成。主頁顯示了一個交互式表逗噩，可以對數(shù)據(jù)庫進(jìn)行排序掉丽，過濾和下載。第二頁顯示每個工具的條目异雁，給出說明捶障，出版物的詳細(xì)信息，軟件代碼和許可證的詳細(xì)信息以及相關(guān)的軟件類別纲刀∠盍叮徽章被添加到工具中，以提供任何相關(guān)軟件或GitHub存儲庫的清晰可見的詳細(xì)信息。最后一頁描述了類別锭部，可以輕松訪問與其相關(guān)的工具暂论。工具和類別頁面都可以以多種方式進(jìn)行分類，包括相關(guān)出版物或引文的數(shù)量空免。另一頁顯示了此處提供的一些分析的實時和最新版本空另，其中使用ggplot2（v2.2.1.9000）生成可視化[ 7]和情節(jié)（v4.7.1）[ 8 ]。我們歡迎通過向GitHub項目頁面（https://github.com/Oshlack/scRNA-tools）提交問題或通過填寫scRNA-tools網(wǎng)站上的提交表單蹋砚，從更廣泛的社區(qū)向數(shù)據(jù)庫做出貢獻(xiàn)扼菠。
ggplot2 (v2.2.1.9000) [7] and plotly (v4.7.1)
分析
? 最新版本的scRNA-tools數(shù)據(jù)庫截至2018年6月6日用于本文提供的分析。使用dplyr包（v0.7.5）[ 9 ] 在R（v3.5.0）中操作數(shù)據(jù)坝咐，并使用ggplot2（v2.2.1.9000）和cowplot（v0.9.2）[ 10 ]包產(chǎn)生圖循榆。
dplyr包（v0.7.5）
ggplot2（v2.2.1.9000）和cowplot（v0.9.2）
結(jié)果
scRNA-tools數(shù)據(jù)庫概述
? 當(dāng)數(shù)據(jù)庫首次構(gòu)建時，它包含70個scRNA-seq分析工具墨坚，代表了自2013年11月至2016年9月SAMstrt [ 11 ] 發(fā)布三年期間該領(lǐng)域的大部分工作秧饮。自那時起超過160個新工具已被添加（圖1A）。在如此短的時間內(nèi)泽篮，可用工具數(shù)量幾乎增加了三倍盗尸，這表明人們對scRNA-seq及其成熟的興趣日益濃厚，從需要定制設(shè)備和專用方案的技術(shù)到商用產(chǎn)品帽撑。
圖1 （A）scRNA-tools數(shù)據(jù)庫中的工具數(shù)量隨著時間的推移泼各。自scRNA-seq工具數(shù)據(jù)庫于2016年9月啟動以來，已發(fā)布了160多種新工具亏拉。（B）scRNA-tools數(shù)據(jù)庫中工具的發(fā)布狀態(tài)扣蜻。完整數(shù)據(jù)庫中超過一半的工具至少有一個已發(fā)布的peer-revirew文件，而另外三個工具在預(yù)印本中有描述及塘。（C）當(dāng)按日期分層工具添加到數(shù)據(jù)庫時莽使，我們看到2016年10月之前添加的大多數(shù)工具都已發(fā)布，而大約一半的新工具僅作為預(yù)印本提供笙僚。更新的工具也更有可能以任何形式取消發(fā)布芳肌。（D）大多數(shù)工具都可以使用R或Python編程語言。（E）大多數(shù)工具都是在標(biāo)準(zhǔn)的開源軟件許可下發(fā)布的味咳，GNU公共許可證（GPL）的變體是最常見的庇勃。但是，大部分工具都找不到許可證槽驶。這些圖的最新版本（C除外）可在scRNA-tools網(wǎng)站的分析頁面上找到（https://www.scrna-tools.org/analysis）。
# preprints預(yù)印品：應(yīng)該是指published前的狀態(tài)的paper
? 出版狀態(tài): 大多數(shù)工具在引入我們注意的出版物或描述其方法和用途的預(yù)印本之后被添加到scRNA工具數(shù)據(jù)庫中鸳兽。在數(shù)據(jù)庫中的所有工具中掂铐，大約一半的工具在同行評審期刊中至少有一個出版物，另外三個在預(yù)印本文章中描述，通常在bioRxiv預(yù)印本服務(wù)器上（圖1B）全陨。工具可以拆分為創(chuàng)建數(shù)據(jù)庫時可用的工具和自之后添加的工具爆班。我們可以看到大多數(shù)舊工具已經(jīng)發(fā)布，而更新的工具更有可能僅作為預(yù)印本提供（圖1C）辱姨。這很好地證明了傳統(tǒng)出版過程所造成的延遲柿菩。通過發(fā)布預(yù)印本和通過GitHub等存儲庫發(fā)布軟件，scRNA-seq工具開發(fā)人員可以更早地將其工具提供給社區(qū)雨涛，使其可用于分析枢舶，并在正式發(fā)布之前改進(jìn)其方法[ 12 ]伐庭。
? 平臺和許可: scRNA-seq分析工具的開發(fā)人員可以選擇使用他們用來創(chuàng)建工具的平臺痪宰，他們?nèi)绾蜗蛏鐓^(qū)提供這些工具以及他們是否共享源代碼诲泌。我們發(fā)現(xiàn)創(chuàng)建scRNA-seq分析工具最常用的平臺是R統(tǒng)計編程語言晦溪，通過Bioconductor或CRAN存儲庫提供了許多工具（圖1D）尤溜。Python是第二種最流行的語言屎债，其次是MATLAB浩聋，一種專有的編程語言祟昭，以及較低級的C ++颅拦。R和Python的使用與它們在一系列數(shù)據(jù)科學(xué)領(lǐng)域的普及性是一致的蒂誉。特別是R的流行反映了其作為分析大量RNA-seq數(shù)據(jù)集和一系列其他生物數(shù)據(jù)類型的首選語言的歷史。
我們發(fā)現(xiàn)創(chuàng)建scRNA-seq分析工具最常用的平臺是R統(tǒng)計編程語言距帅，通過Bioconductor或CRAN存儲庫提供了許多工具
# R包很多
? scRNA-tools數(shù)據(jù)庫中的大多數(shù)工具都是采用開源方法開發(fā)的右锨，使得它們的代碼在許可軟件許可下可用（圖1E））。我們認(rèn)為這反映了生物信息學(xué)社區(qū)分享和建立他人工作的一般潛在情感和意愿锥债。GNU公共許可證（GPL）的變化是最常見的陡蝇，幾乎覆蓋了一半的工具。此許可證允許免費使用哮肚，修改和分發(fā)源代碼登夫，但也具有“copyleft”性質(zhì)，要求任何衍生工具披露其源代碼并使用相同的許可證允趟。MIT許可證是第二大最受歡迎的許可證恼策，它允許出于任何目的使用代碼，但對分發(fā)或許可沒有任何限制潮剪。幾乎四分之一的工具無法識別相應(yīng)的許可證涣楷。這是有問題的，因為開發(fā)人員必須假設(shè)源代碼不能被重用抗碰，這可能會限制這些工具中方法的有用性狮斗。
scRNA-seq分析的類別
? 單細(xì)胞RNA測序通常用于以無監(jiān)督的方式探索細(xì)胞類型的復(fù)雜混合物。正如在以前的評論中描述在此設(shè)置一個標(biāo)準(zhǔn)scRNA-seq的分析包括可以使用各種工具[完成幾個任務(wù)13 - 17 ]弧蝇。在scRNA-tools數(shù)據(jù)庫中碳褒，我們根據(jù)工具執(zhí)行的分析任務(wù)對工具進(jìn)行分類折砸。在這里，我們將這些任務(wù)分為四個廣泛的分析階段：數(shù)據(jù)采集沙峻，數(shù)據(jù)清理睦授，細(xì)胞分配和基因鑒定（圖2）。數(shù)據(jù)采集階段（階段1）從測序?qū)嶒炛蝎@取原始核苷酸序列摔寨，并返回描述每個細(xì)胞中每個基因表達(dá)的矩陣去枷。該階段包括大量RNA-seq實驗常見的任務(wù)，例如與參考基因組或轉(zhuǎn)錄組的比對以及表達(dá)的定量是复，但通常擴(kuò)展到處理獨特的分子標(biāo)識符（UMI）[ 18]]删顶。一旦獲得表達(dá)矩陣，確保結(jié)果數(shù)據(jù)具有足夠高的質(zhì)量至關(guān)重要佑笋。在數(shù)據(jù)清洗階段（階段2）翼闹，進(jìn)行細(xì)胞的質(zhì)量控制以及過濾無信息基因〗常可以執(zhí)行附加任務(wù)以標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)或估算缺失值猎荠。探索性數(shù)據(jù)分析任務(wù)通常在此階段執(zhí)行，例如以縮小的維度查看數(shù)據(jù)集以查找底層結(jié)構(gòu)蜀备。
# 數(shù)據(jù)采集
大量RNA-seq實驗常見的任務(wù)关摇，例如與參考基因組或轉(zhuǎn)錄組的比對以及表達(dá)的定量，處理UMI碾阁，得到表達(dá)矩陣
# 數(shù)據(jù)清理
細(xì)胞的質(zhì)量控制以及過濾無信息基因
以標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)或估算缺失值
探索數(shù)據(jù)集：探索性數(shù)據(jù)分析任務(wù)通常在此階段執(zhí)行输虱，例如以縮小的維度查看數(shù)據(jù)集以查找底層結(jié)構(gòu)。
圖2.典型的無監(jiān)督scRNA-seq分析過程的階段脂凶。
? 在階段1（數(shù)據(jù)采集）中宪睹，通過細(xì)胞表達(dá)矩陣將原始測序讀數(shù)轉(zhuǎn)換成基因。對于許多方案蚕钦，這需要基因與參考基因組的比對以及獨特分子標(biāo)識符（UMI）的分配和重復(fù)數(shù)據(jù)刪除亭病。然后清除數(shù)據(jù)（階段2）以去除低質(zhì)量細(xì)胞和無信息基因，從而產(chǎn)生用于進(jìn)一步分析的高質(zhì)量數(shù)據(jù)集嘶居。數(shù)據(jù)也可以歸一化罪帖，并在此階段估算缺失值。階段3以離散方式將細(xì)胞分配給已知（分類）或未知（聚類）組或連續(xù)軌跡上的位置邮屁。然后鑒定有趣的基因（例如整袁，差異表達(dá)的，標(biāo)記佑吝，特定的表達(dá)模式）以解釋這些組或軌跡（階段4）坐昙。
? 高質(zhì)量的表達(dá)矩陣是下一階段分析的重點。在階段3中芋忿，通過聚類或沿著從一種細(xì)胞類型到另一種細(xì)胞類型的連續(xù)軌跡將細(xì)胞分配給離散組民珍。隨著高質(zhì)量參考數(shù)據(jù)集的出現(xiàn)襟士，將細(xì)胞直接分類為不同細(xì)胞類型也變得可行盗飒。一旦分配了細(xì)胞嚷量，分析的焦點就轉(zhuǎn)向解釋這些分配的含義。識別有趣的基因（第4階段）逆趣，例如那些在組間差異表達(dá)的基因蝶溶，在單個組中表達(dá)的標(biāo)記基因或沿著軌跡改變表達(dá)的基因，是這樣做的典型方法宣渗。然后可以通過研究基因本身或通過技術(shù)或數(shù)據(jù)集試驗來獲得更高水平概括來解釋實驗中這些基因的生物學(xué)意義抖所，從而為實驗提供意義。
# 細(xì)胞分配-聚類分析
一種細(xì)胞類型到另一種細(xì)胞類型的連續(xù)軌跡將細(xì)胞分配
分析重點：解釋分配的含義
# 基因鑒定
找到有趣基因
? 雖然可以采用其他方法來分析scRNA-seq數(shù)據(jù)痕囱，但這些階段代表了從原始測序讀數(shù)到適用于許多研究的生物學(xué)見解的最常見途徑田轧。例外情況可能是設(shè)計用于測試特定假設(shè)的實驗，其中細(xì)胞群可能已被分類鞍恢，或者興趣在于實驗條件而非細(xì)胞類型之間的差異傻粘。在這種情況下，可能不需要階段3帮掉，并且可以使用略微不同的工具或方法弦悉，但是將應(yīng)用許多相同的挑戰(zhàn)。此外蟆炊，隨著該領(lǐng)域的擴(kuò)展和發(fā)展稽莉，數(shù)據(jù)可能會以新的方式用于回答其他生物學(xué)問題，需要新的分析技術(shù)涩搓。表1中給出了scRNA工具數(shù)據(jù)庫中類別的描述污秆，以及相關(guān)的分析階段。
表1. scRNA-tools數(shù)據(jù)庫中工具類別的描述昧甘。
? scRNA-seq分析任務(wù)的趨勢： 數(shù)據(jù)庫中的每個工具都分配給一個或多個分析類別良拼。我們進(jìn)一步詳細(xì)研究了這些類別，以深入了解scRNA-seq分析的趨勢疾层。圖3A顯示了執(zhí)行每個分析任務(wù)的工具的頻率将饺。可視化是最常見的任務(wù)，在探索和顯示數(shù)據(jù)和結(jié)果的所有分析階段都很重要痛黎。分配單元格的任務(wù)（排序和聚類）是下一個最常見的任務(wù)予弧。這一直是與集群工具在單細(xì)胞分析發(fā)展的最大面積，例如Seurat [ 19湖饱，20 ]掖蛤，SC3 [ 21 ]和BackSPIN [ 22]所使用的樣品和軌跡分析工具來識別的細(xì)胞類型（例如單片眼鏡[ 23 - 25]，橫臂[ 26 ]和DPT [ 27 ]）被用來研究基因跨越發(fā)育過程如何變化井厌。這些領(lǐng)域反映了單細(xì)胞數(shù)據(jù)提供的新分析機(jī)會蚓庭，這是大量RNA-seq實驗無法實現(xiàn)的致讥。
tools：
1. 可視化最多（含降維）
2. 細(xì)胞的排序和聚類：例如Seurat、SC3器赞、和BackSPIN９父ぁ！港柜！
圖3（A）scRNA-tools數(shù)據(jù)庫中的工具類別请契。可以根據(jù)可以完成的任務(wù)將每個工具分配到多個類別夏醉。與多個分析階段（可視化爽锥，降維）相關(guān)聯(lián)的類別是最常見的類別，與細(xì)胞分配階段（排序畔柔，聚類）相關(guān)聯(lián)的類別也是最常見的氯夷。（B）分析類別隨時間的變化，比較2016年10月之前和之后添加的工具靶擦。與可視化腮考，降維，基因網(wǎng)絡(luò)和模擬相關(guān)的工具百分比顯著增加奢啥。包括表達(dá)模式秸仙，排序和交互性在內(nèi)的類別相對減少。（C）隨著時間的推移與分析階段相關(guān)的工具百分比的變化桩盲。數(shù)據(jù)采集和數(shù)據(jù)清理階段涉及的工具百分比增加寂纪，為替代分析任務(wù)設(shè)計的工具也增加了《慕幔基因識別階段的工具數(shù)量相對減少捞蛋。（D）與scRNA-tools數(shù)據(jù)庫中的每個工具相關(guān)的類別數(shù)。大多數(shù)工具執(zhí)行的任務(wù)很少柬姚。（E）完成許多任務(wù)的大多數(shù)工具都是相對較新的拟杉。
? 降維也是一項常見任務(wù)，可應(yīng)用于可視化（通過諸如t-SNE [ 28 ]等技術(shù)）量承，質(zhì)量控制和作為分析的起點搬设。差異表達(dá)（DE）測試可能是對大量RNA-seq數(shù)據(jù)集進(jìn)行的最常見分析，它也常用于許多scRNA-seq分析工具撕捍，通常用于鑒定一組細(xì)胞中與其他細(xì)胞不同的基因拿穴。 然而，應(yīng)當(dāng)注意的是忧风，通過scRNA-SEQ工具施加的DE測試往往是不那么復(fù)雜的工具嚴(yán)格的統(tǒng)計結(jié)構(gòu) bulk RNA-SEQ開發(fā)諸如edgeR[ 29默色，30 ]，DESeq2 [ 31 ]和LIMMA [ 32]狮腿，經(jīng)常使用簡單的統(tǒng)計檢驗腿宰，如似然比檢驗呕诉。雖然方法設(shè)計測試DE特別是在單細(xì)胞數(shù)據(jù)集確實存在（如SCDE [ 33 ]，和SCDD [ 34 ]）吃度，目前還不清楚他們是否在已經(jīng)建立了大容量數(shù)據(jù)[方法提高35 - 37 ]甩挫，與日期發(fā)現(xiàn)最全面的比較，批量方法的表現(xiàn)并不比scRNA-seq數(shù)據(jù)設(shè)計的差[ 38 ]规肴。
降維也是一項常見任務(wù)捶闸，可應(yīng)用于可視化（通過諸如t-SNE等技術(shù)）
差異表達(dá)（DE）測試可能是對大量RNA-seq數(shù)據(jù)集進(jìn)行的最常見分析，它也常用于許多scRNA-seq分析工具拖刃。通常用于鑒定一組細(xì)胞中與其他細(xì)胞不同的基因。
# 比較
bulk RNA-seq工具施加的DE測試:edgeR贪绘、DESeq2 兑牡、LIMMA
設(shè)計測試DE特別是在單細(xì)胞數(shù)據(jù)集確實存在（如SCDE和SCDD），目前還不清楚他們是否在已經(jīng)建立了大容量數(shù)據(jù)
? 為了研究scRNA-seq工具開發(fā)的重點如何隨著時間的推移而改變税灌，我們再次將scRNA-tools數(shù)據(jù)庫劃分為2016年10月之前和之后添加的工具均函。這使我們能夠看到哪些分析任務(wù)在最近發(fā)布的工具中更常見。我們研究了在不同分析類別中執(zhí)行任務(wù)的每個時間段內(nèi)的工具百分比（圖3B））菱涤。某些類別顯示執(zhí)行它們的工具比例變化不大苞也，而其他區(qū)域發(fā)生了顯著變化。具體而言粘秆，最近的工具更常見地解決了可視化和降維問題如迟。UMI種類最近也出現(xiàn)了大幅增長，因為基于UMI的方案已經(jīng)普遍使用攻走，并且已經(jīng)開發(fā)了用于處理所需額外處理步驟的工具（例如UMI-tools [ 39 ]殷勘，umis [ 40 ]，zUMIs [ 41 ]） 昔搂。模擬是開發(fā)玲销，測試和驗證scRNA-seq工具的有用技術(shù)。現(xiàn)在有更多的軟件包包括它們的模擬功能摘符，并且已經(jīng)開發(fā)了一些工具用于生成真實的合成scRNA-seq數(shù)據(jù)集的特定目的（例如powsimR [ 42]]贤斜，Splatter [ 43 ]）。隨著參考數(shù)據(jù)集變得可用并且更多工具識別或利用共同調(diào)節(jié)的基因網(wǎng)絡(luò)逛裤，細(xì)胞分類成已知組也已增加瘩绒。
UMI處理工具：
UMI-tools 、umis 别凹、zUMIs
合成真實數(shù)據(jù)的R：powsimR 草讶、Splatter
? 有些類別的工具比例有所下降，最引人注目的是沿著軌跡測試表達(dá)模式炉菲。這可能與細(xì)胞排序分析的變化有關(guān)堕战，細(xì)胞排序分析是2016年10月之后添加的較低百分比工具的重點坤溃。細(xì)胞沿著軌跡的排序是scRNA-seq分析的最初發(fā)展之一，并且這些工具的開發(fā)可能表明研究人員已經(jīng)轉(zhuǎn)向其他技術(shù)嘱丢，或者已經(jīng)將這些技術(shù)融合到一套成熟的工具上薪介。
細(xì)胞排序分析策略，早期出現(xiàn)的越驻，也有可能未來被更新~
? 通過基于相關(guān)分析階段對類別進(jìn)行分組汁政，我們可以看到類似的趨勢（圖3C））。我們看到缀旁，在多個階段（例如可視化和降維）和替代分析任務(wù)中记劈，在階段1（量化）中執(zhí)行任務(wù)的工具百分比有所增加。相比之下并巍，執(zhí)行基因識別任務(wù)（第4階段）的工具的百分比已經(jīng)減少目木，并且分配細(xì)胞的百分比（階段3）保持穩(wěn)定。階段2（質(zhì)量控制和過濾）隨著時間的推移而波動懊渡，但目前處于略高于首次創(chuàng)建數(shù)據(jù)庫時的水平刽射。這也表明分析空間的成熟，因為開發(fā)人員偏離了批量RNA-seq分析的重點任務(wù)剃执，并繼續(xù)關(guān)注scRNA-seq特有的那些誓禁，同時致力于處理來自新方案的數(shù)據(jù)和執(zhí)行替代方案的方法分析任務(wù)。
? 管道和工具箱： 雖然有相當(dāng)數(shù)量的scRNA-seq工具只執(zhí)行單個分析任務(wù)肾档，但許多工作至少執(zhí)行兩次（圖3D）摹恰。一些工具（dropEst [ 44 ]，DrSeq2 [ 45 ]阁最，scPipe [ 46 ]）是預(yù)處理管道戒祠，采用原始測序讀取并產(chǎn)生表達(dá)矩陣。其他如Scanpy [ 47 ]速种，SCell [ 48 ]姜盈，Seurat，Monocle和scater [ 49 ]可以被認(rèn)為是分析工具箱配阵，能夠從基因表達(dá)矩陣開始完成一系列復(fù)雜分析馏颂。完成許多任務(wù)的大多數(shù)工具都是相對較新的（圖3E）。能夠使用單個工具完成多個任務(wù)可以簡化分析棋傍，因為可以避免在不同數(shù)據(jù)格式之間轉(zhuǎn)換的問題救拉。然而，重要的是要記住瘫拣，具有許多功能的工具難以繼續(xù)代表所有這些功能的現(xiàn)有技術(shù)亿絮。支持通用數(shù)據(jù)格式，例如最近發(fā)布的SingleCellExperiment [ 50 ]，anndata [ 47 ]或loom（http://loompy.org）對象派昧，為開發(fā)人員提供了另一種方式黔姜，允許他們輕松使用他們的工具，并為用戶構(gòu)建自定義專業(yè)工具的工作流程蒂萎。
一些工具（dropEst 秆吵、DrSeq2 、scPipe）是預(yù)處理管道五慈，采用原始測序讀取并產(chǎn)生表達(dá)矩陣纳寂。
Scanpy 、SCell泻拦、Seurat毙芜，Monocle和scater可以被認(rèn)為是分析工具箱，能夠從基因表達(dá)矩陣開始完成一系列復(fù)雜分析
? 替代分析： 一些工具執(zhí)行的分析不在上述scRNA-seq數(shù)據(jù)上執(zhí)行的常見任務(wù)之外聪轿。模擬是已經(jīng)提到的一個替代任務(wù)爷肝，但是還有一組工具被設(shè)計用于檢測除了表達(dá)變化之外的scRNA-seq數(shù)據(jù)中的生物信號。例如陆错，識別可變剪接（BRIE [ 51 ]，Outrigger [ 52 ]金赦，SingleSplice [ 53 ]）音瓷，單核苷酸變異（SSrGE [ 54 ]），拷貝數(shù)變異（inferCNV [ 55 ]）和等位基因特異性表達(dá)（SCALE [ 56] ]）夹抗。免疫細(xì)胞受體的重建是另一個區(qū)域绳慎，收到相當(dāng)關(guān)注的領(lǐng)域，例如BASIC [ 57 ]漠烧，TraCeR 等工具杏愤。58 ]和TRAPeS [ 59 ]。雖然完成這些任務(wù)的工具不太可能主導(dǎo)scRNA-seq分析已脓，但我們期望看到研究專業(yè)分析的方法有所增加珊楼，因為研究人員繼續(xù)推動使用scRNA-seq數(shù)據(jù)觀察到的界限。
單細(xì)胞也可以分析的類別：
識別可變剪接：BRIE度液、Outrigger厕宗、SingleSplice
單核苷酸變異（SSrGE）
拷貝數(shù)變異（inferCNV）
等位基因特異性表達(dá)（SCALE）
免疫細(xì)胞受體的重建： BASIC、TraCeR 堕担、TRAPeS
可用性和未來方向
? 自2016年10月以來已慢，我們已經(jīng)看到用于分析單細(xì)胞RNA-seq數(shù)據(jù)的軟件工具數(shù)量超過三倍，現(xiàn)在有超過230種分析工具可用霹购。隨著新工具的推出佑惠，我們已經(jīng)在scRNA工具數(shù)據(jù)庫中對其進(jìn)行了策劃和編目，在這些數(shù)據(jù)庫中我們記錄了他們可以完成的分析任務(wù)，以及其他信息膜楷，例如任何相關(guān)的出版物旭咽。通過分析該數(shù)據(jù)庫，我們發(fā)現(xiàn)工具開發(fā)人員將他們的大部分精力集中在處理scRNA-seq數(shù)據(jù)特有的新問題的方法上把将，特別是將細(xì)胞聚類成組或沿著軌跡對它們進(jìn)行排序轻专。
? 未來幾年有望在scRNA-seq分析中產(chǎn)生重大的新發(fā)展。將繼續(xù)生產(chǎn)新工具察蹲，變得越來越復(fù)雜请垛，旨在解決scRNA-seq數(shù)據(jù)可能帶來的更多問題。我們預(yù)計一些現(xiàn)有工具將繼續(xù)改進(jìn)和擴(kuò)展其功能洽议，而其他工具將不再更新和維護(hù)宗收。詳細(xì)的基準(zhǔn)測試和比較將顯示工具在不同情況下的表現(xiàn)以及表現(xiàn)良好，持續(xù)開發(fā)并提供良好用戶體驗的工具將成為標(biāo)準(zhǔn)分析的首選亚兄。隨著單細(xì)胞捕獲和測序技術(shù)不斷改進(jìn)混稽，分析工具必須適應(yīng)可能需要專門數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)和算法的顯著更大的數(shù)據(jù)集（在數(shù)百萬個細(xì)胞中）。組合多個scRNA-seq數(shù)據(jù)集以及將scRNA-seq數(shù)據(jù)與其他單細(xì)胞數(shù)據(jù)類型（例如DNA-seq审胚，ATAC-seq或甲基化）整合的方法將是另一個增長領(lǐng)域匈勋。此外，Human Cell Atlas等項目[60]將提供全面的細(xì)胞類型參考膳叨，將開辟新的分析途徑洽洁。
組合多個scRNA-seq數(shù)據(jù)集以及將scRNA-seq數(shù)據(jù)與其他單細(xì)胞數(shù)據(jù)類型（例如DNA-seq，ATAC-seq或甲基化）整合的方法將是另一個增長領(lǐng)域.
# 多組學(xué)分析
Human Cell Atlas等項目
? 隨著該領(lǐng)域的擴(kuò)展菲嘴，scRNA-tools數(shù)據(jù)庫將繼續(xù)在社區(qū)的支持下進(jìn)行更新饿自。我們希望它為研究人員提供了一種資源，可以在接近scRNA-seq分析時進(jìn)行探索龄坪，并提供分析前景及其隨時間變化的記錄昭雌。
可用性
? scRNA-tools數(shù)據(jù)庫可通過網(wǎng)站www.scRNA-tools.org公開訪問。有關(guān)添加健田，更新和改進(jìn)的建議在相關(guān)的GitHub存儲庫（https://github.com/Oshlack/scRNA-tools）或網(wǎng)站上的提交表單中受到熱烈歡迎烛卧。本文中用于分析的代碼和數(shù)據(jù)集可從https://github.com/Oshlack/scRNAtools-paper獲得。
scRNA-tools:
(https://github.com/Oshlack/scRNAtools-paper)
致謝
? 我們要感謝Sean Davis在管理令人敬畏的單細(xì)胞page和生成用于處理數(shù)據(jù)庫的腳本原型方面的工作抄课。Daniel Wells有想法記錄軟件許可證唱星，并為當(dāng)時數(shù)據(jù)庫中的工具提供許可證。Breon Schmidt設(shè)計了scRNA-tools網(wǎng)站的原型跟磨，回答了很多關(guān)于HTML和Javascript的問題间聊。我們還要感謝Matt Ritchie對早期版本手稿的看法。
彩蛋
請認(rèn)真看表1：理解任務(wù)分為四個廣泛的分析階段：數(shù)據(jù)采集抵拘，數(shù)據(jù)清理哎榴，細(xì)胞分配和基因鑒定（并非全部都必須）
