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這一篇文章，類似單細(xì)胞RNA-seq 最佳實(shí)踐教程闯两，對(duì)每一步進(jìn)行了具體介紹討論钟病。
目前技術(shù)和分析方法都出現(xiàn)了好多，看一些綜述有一個(gè)整體把握姑子。
Computational and Structural Biotechnology Journal--微信解讀 2020.06
摘 要
大多數(shù)與人類復(fù)雜性狀相關(guān)的遺傳變異都位于基因組非編碼區(qū)乎婿，其中大部分元件都與基因表達(dá)調(diào)控息息相關(guān)，因此街佑，想要了解從基因型到表型的全貌就需要了解基因組非編碼區(qū)內(nèi)元件的功能谢翎。
目前捍靠，ATAC-seq 是測(cè)定全基因組染色質(zhì)開放區(qū)分布最可行且最高效的方法，scATAC-seq 技術(shù)則應(yīng)用于研究異質(zhì)細(xì)胞群體中特定細(xì)胞類型的染色質(zhì)開放區(qū)岳服。然而剂公，由于 scATAC-seq 數(shù)據(jù)存在高噪聲和高稀疏等特性，很難準(zhǔn)確提取生物學(xué)信號(hào)并設(shè)計(jì)有效的生物學(xué)假設(shè)吊宋。
為了克服這些限制纲辽，近幾年開發(fā)了很多算法和軟件工具。但目前針對(duì) scATAC-seq 數(shù)據(jù)分析的最佳方法尚無(wú)共識(shí)璃搜。本綜述討論了 scATAC-seq 技術(shù)和數(shù)據(jù)分析方法拖吼，從預(yù)處理到下游分析，并列舉了涉及相關(guān)方法應(yīng)用的已發(fā)表研究这吻。希望本綜述為如何適當(dāng)使用軟件工具和數(shù)據(jù)庫(kù)研究單細(xì)胞分辨率下的染色質(zhì)可及性提供指導(dǎo)吊档。
1.簡(jiǎn)介
ATAC-seq 是檢測(cè)全基因組染色質(zhì)開放區(qū)的方法，高活性的 Tn5 轉(zhuǎn)座酶可以在片段化染色質(zhì)開放區(qū) DNA 序列的同時(shí)進(jìn)行標(biāo)記唾糯，與其他方法相比怠硼，ATAC-seq 所需的樣品制備時(shí)間更短，樣本起始量更少移怯。隨著單細(xì)胞生物學(xué)的出現(xiàn)以及與其他組學(xué)技術(shù)測(cè)序技術(shù)相適應(yīng)和發(fā)展香璃，從單細(xì)胞水平進(jìn)行染色質(zhì)可及性研究成為可能，但 scATAC-seq 數(shù)據(jù)分析仍然具有挑戰(zhàn)性舟误。如果沒(méi)有對(duì) scATAC-seq 數(shù)據(jù)的充分了解葡秒，染色質(zhì)開放區(qū)內(nèi)各種潛在功能元件必定會(huì)增加 scATAC-seq 數(shù)據(jù)解析的復(fù)雜性。近幾年開發(fā)了很多用于 scATAC-seq 數(shù)據(jù)分析的算法和軟件工具嵌溢，但是眯牧，必須仔細(xì)選擇數(shù)據(jù)分析流程每個(gè)步驟的算法和參數(shù)，才能將染色質(zhì)可及性信息可靠地轉(zhuǎn)換為新的生物學(xué)假設(shè)赖草。
本綜述旨在詳細(xì)闡述 scATAC-seq 數(shù)據(jù)分析從預(yù)處理到各種下游分析的流程学少。與其他 NGS 數(shù)據(jù)的分析相似，scATAC-seq 數(shù)據(jù)也需要進(jìn)行預(yù)處理秧骑。一些軟件工具廣泛用于序列信息的質(zhì)量控制版确，參考基因組比對(duì)以及候選染色質(zhì)開放區(qū)域峰的鑒定。預(yù)處理后生成 cell-feature 矩陣的生成對(duì)于 scATAC-seq 數(shù)據(jù)分析至關(guān)重要腿堤，將預(yù)處理后的數(shù)據(jù)用于下游分析，以闡明順式調(diào)控元件（例如啟動(dòng)子和增強(qiáng)子）和反調(diào)控元件（例如 TF）之間的網(wǎng)絡(luò)如暖。scATAC-seq 數(shù)據(jù)還可以進(jìn)行基因活性和遺傳變異的可及性等分析笆檀。此外，scATAC-seq 能與 scRNA-seq 數(shù)據(jù)及其他組學(xué)數(shù)據(jù)聯(lián)合進(jìn)行多組學(xué)研究盒至。
圖1. 經(jīng)典的scATAC-seq數(shù)據(jù)處理流程示意圖
2.scATAC-seq 技術(shù)
在 ATAC-seq 技術(shù)發(fā)展的兩年內(nèi)酗洒，引入了兩種不同的單細(xì)胞適應(yīng)策略：一是基于 split-and-pool 的原理為單個(gè)細(xì)胞標(biāo)記上獨(dú)特的 DNA barcode士修。例如 sci-ATAC-seq；另一個(gè)是微流體方法樱衷，例如使用 IFC棋嘲。在 sci-ATAC-seq 中，將裂解的細(xì)胞核置于攜有獨(dú)特 barcode 轉(zhuǎn)座酶的96孔板中矩桂，再混合在一起沸移，然后使用 FACS 分配到第二個(gè)96孔板中，在擴(kuò)增過(guò)程中引入第二個(gè) barcode侄榴，通過(guò)識(shí)別兩個(gè) barcode 的獨(dú)特組合識(shí)別單個(gè)細(xì)胞雹锣。sci-ATAC-seq 可以對(duì)約1500個(gè)細(xì)胞進(jìn)行測(cè)序，中位讀數(shù)為2500癞蚕，碰撞率約為11％蕊爵。而 IFC scATAC-seq 利用 Fluidigm C1 設(shè)備捕獲單個(gè)細(xì)胞并在 IFC 上進(jìn)行轉(zhuǎn)座和PCR。盡管此方法每個(gè)細(xì)胞可以獲得超過(guò)70000次讀取桦山，但最多只能并行處理96個(gè)細(xì)胞攒射。最近，10x Genomics Chromium 裝置基于微流體的方法恒水，使用 GEM 捕獲單個(gè)被轉(zhuǎn)座的細(xì)胞核会放。GEM 的可擴(kuò)展性和高通量與數(shù)據(jù)處理軟件 Cell Ranger ATAC 相結(jié)合可以對(duì)大量細(xì)胞進(jìn)行 scATAC-seq 研究，也使得該方法廣受歡迎寇窑。
目前已有更多技術(shù)對(duì)上述單細(xì)胞技術(shù)進(jìn)行改進(jìn)鸦概。Pi-ATAC 與 DNA 轉(zhuǎn)座平行的分析蛋白質(zhì)表位，以量化同一單個(gè)細(xì)胞的蛋白質(zhì)表達(dá)和染色質(zhì)可及性甩骏。scip-ATAC-seq 提高了轉(zhuǎn)座酶進(jìn)入細(xì)胞核的效率窗市，從而提高了文庫(kù)的復(fù)雜性和分辨率。T-ATAC-seq 使用 ATAC-seq 對(duì) T 細(xì)胞受體編碼基因進(jìn)行測(cè)序饮笛。Perturb-ATAC 在轉(zhuǎn)座后添加 CRISPR sgRNA咨察，并對(duì) sgRNA 和 ATAC DNA 進(jìn)行測(cè)序，以研究調(diào)節(jié)染色質(zhì)可及性因素之間的關(guān)系福青∩阌基于 Plate 的 scATAC-seq 促進(jìn)了文庫(kù)的復(fù)雜性，也使線粒體 DNA 的量更少无午，F(xiàn)RiP 的分?jǐn)?shù)更高媒役。dsciATAC-seq可以保持基于微流體的 scATAC-seq 的測(cè)序深度，同時(shí)并行提高細(xì)胞通量宪迟。μATAC-seq 采用 ICELL8 平臺(tái)酣衷，以高通量和低文庫(kù)制備成本提供單細(xì)胞測(cè)序。在選擇 scATAC-seq 技術(shù)之前次泽，重要的是要考慮實(shí)驗(yàn)設(shè)備的可用性及其與分析軟件的兼容性穿仪、所需的測(cè)序深度席爽、細(xì)胞通量以及研究的總體目的。
圖2. scATAC-seq 文庫(kù)生成的兩種主要策略：（a）split-and-pool 的原理為單個(gè)細(xì)胞標(biāo)記上獨(dú)特的 DNA barcodes方法和（b）基于微流控技術(shù)方法以及（c）其修改方法啊片。
3 數(shù)據(jù)處理
在通過(guò)下游分析生成生物學(xué)假設(shè)之前只锻，為準(zhǔn)確解析 scATAC-seq 數(shù)據(jù)必須進(jìn)行數(shù)據(jù)預(yù)處理步驟。scATAC-seq 數(shù)據(jù)的預(yù)處理從測(cè)序文件的拆解和低質(zhì)量細(xì)胞的刪除開始紫谷，再仔細(xì)選擇用于cell-feature 矩陣的基因組區(qū)域齐饮、數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換方法、降維方法以及用于注釋細(xì)胞類型的方法碴里。此外沈矿，必要時(shí)須刪除批次效應(yīng)。由于數(shù)據(jù)分析中沒(méi)有萬(wàn)能藥咬腋，因此對(duì)多種方法與互補(bǔ)算法進(jìn)行比較羹膳，才能從給定的數(shù)據(jù)集中獲得最佳結(jié)果。表1總結(jié)了可用于 scATAC-seq 數(shù)據(jù)分析的13個(gè)軟件包：ChromVAR根竿、SCRAT陵像、scABC、Cicero寇壳、Scasat醒颖、ciscisic、snapATAC壳炎、epiScanpy泞歉、Destin、SCALE匿辩、scATAC-pro腰耙、Signac 和 ArchR 。盡管下游分析的能力各不相同铲球，但它們都包含獨(dú)特的預(yù)處理步驟挺庞。
表1. scATAC-seq 分析軟件包概況
3.1. 測(cè)序讀段的處理
如果多個(gè)樣品在一個(gè)反應(yīng)中混合測(cè)序，則需要使用如 Illumina 的 bcl2fastq 等軟件包根據(jù) index 接頭序列進(jìn)行樣品拆分稼病。然后选侨，使用 Bowtie2 或 Trimmomatic 修整接頭序列和引物序列；使用 Bowtie2 或 BWA 將讀段與基因組進(jìn)行比對(duì)然走，并用 Samtools 進(jìn)行排序援制。
3.2. 質(zhì)量控制
低質(zhì)量細(xì)胞或者多細(xì)胞將通過(guò)數(shù)據(jù)預(yù)處理去除。大多數(shù)單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)的 QC 標(biāo)準(zhǔn)都基于每個(gè)細(xì)胞對(duì)應(yīng) barcode 的讀段數(shù)目（測(cè)序深度）和特征數(shù)目芍瑞，過(guò)低或者過(guò)高的數(shù)值可能是由于低質(zhì)量細(xì)胞或者多細(xì)胞引起的晨仑。根據(jù) scATAC-seq 數(shù)據(jù)的特性也響應(yīng)產(chǎn)生了更豐富的 QC 指標(biāo)，如 FRiP、啟動(dòng)子區(qū)域讀段比例寻歧、blacklist 位點(diǎn)讀段比例及 TSS 富集分?jǐn)?shù)等。此外秩仆，沒(méi)有顯示出高質(zhì)量 ATAC-seq 數(shù)據(jù)的核小體結(jié)合模式的細(xì)胞也可以被去除码泛。除 barcode 外，位于 blacklist 區(qū)域或管家基因中的特征（如 peak）也可以被濾除澄耍。并非所有樣品都符合絕對(duì)的 QC 標(biāo)準(zhǔn)噪珊。因此，必須根據(jù)樣品的特征（如數(shù)據(jù)的整體結(jié)構(gòu)齐莲、異質(zhì)性痢站、可能存在的細(xì)胞類型、批次或測(cè)序平臺(tái)）仔細(xì)選擇 QC 標(biāo)準(zhǔn)的組合选酗。
3.3. cell-feature 矩陣構(gòu)成
通過(guò) QC 的 cell-feature 矩陣將被用于下游分析阵难。原始 peak 或根據(jù)調(diào)控因子注釋的 feature 使數(shù)據(jù)呈多元化。盡管大多數(shù)分析流程用定義和注釋基因組區(qū)域作為單一組合芒填，但某些流程針對(duì)下游分析的不同目的而適應(yīng)各種合適的矩陣呜叫。基因組區(qū)域的定義可以根據(jù)樣品的特定信息來(lái)分類殿衰，feature 注釋可以隨感興趣的調(diào)控元件而改變朱庆。樣本的特定信息包括利用公開數(shù)據(jù)中的bulk ATAC-seq的peak、scATAC-seq 數(shù)據(jù)中的集合或合并 peak闷祥。還可以根據(jù)樣本來(lái)源或者初始細(xì)胞分群對(duì)細(xì)胞進(jìn)行劃分再使用 MACS2 進(jìn)行 peak 識(shí)別娱颊。另一種方法是將基因組劃分為特定大小的窗口，并統(tǒng)計(jì)每個(gè)窗口中讀段豐度作為每個(gè)窗口的分值凯砍。通過(guò)定義peak箱硕、窗口、調(diào)控元件（TF motif 果覆、TSS等）產(chǎn)生 cell-feature 矩陣颅痊。由于不同細(xì)胞類型存在特異的 TF 的 motif 或 k-mers 的信息，因此一些分析流程用此信息注釋細(xì)胞類型局待“呦欤基因組區(qū)域可以用公共數(shù)據(jù)庫(kù)（如cisBP、JASPAR钳榨、HOMER）的已知 TF motif進(jìn)行注釋舰罚，還能使用 motif 匹配 k-mers 進(jìn)行無(wú)監(jiān)督注釋。此外薛耻，TSS 的可及性也可作為細(xì)胞類型特異的 feature营罢。這些基因組 feature 會(huì)結(jié)合在一起形成一個(gè)集合以準(zhǔn)確分析細(xì)胞異質(zhì)性。一些工具簡(jiǎn)單地合并鄰近 peak 或直接將它們用作生成的 feature，而無(wú)需注釋基因組元素饲漾。
3.4. 批次校正和數(shù)據(jù)整合
當(dāng)需要同時(shí)分析多批次的 scATAC-seq 數(shù)據(jù)時(shí)蝙搔，一些非生物學(xué)因素（例如技術(shù)差異）可能會(huì)導(dǎo)致錯(cuò)誤的生物學(xué)假設(shè)。批次效應(yīng)的產(chǎn)生可能來(lái)源于實(shí)驗(yàn)人員考传、樣品制備方案吃型、樣品獲得時(shí)間、測(cè)序通道和測(cè)序技術(shù)的差異僚楞。scATAC-seq 數(shù)據(jù)的批次效應(yīng)校正通常是在沒(méi)有特定計(jì)算工具的情況下間接進(jìn)行的勤晚，通過(guò)仔細(xì)檢查可以去除批次特定的 feature。批處理效果通常在其他預(yù)處理步驟中得到糾正泉褐，例如選擇高變 peak 或降維赐写。使用基于非線性算法的數(shù)據(jù)集成方法可更系統(tǒng)地糾正單細(xì)胞組學(xué)數(shù)據(jù)的批次效應(yīng)。這些方法假設(shè)所有批次至少共享一種細(xì)胞類型膜赃，且批次之間的差異小于細(xì)胞類型之間的差異挺邀。但這些方法也可能消除生物學(xué)差異，從而導(dǎo)致過(guò)度校正跳座。因此悠夯，既要考慮批次消除的能力，又要考慮對(duì)生物學(xué)差異的保護(hù)躺坟。盡管沒(méi)有用于集成 scATAC-seq 數(shù)據(jù)的指定工具沦补，但可以使用為 scRNA-seq 開發(fā)的工具。對(duì)具有 atlas-level 的 scATAC-seq 數(shù)據(jù)集成工具進(jìn)行的基準(zhǔn)研究表明咪橙，大多數(shù)工具的性能較差夕膀，這可能歸因于數(shù)據(jù)的稀疏性和二進(jìn)制性質(zhì)。Harmony 美侦，Seurat v3 和 scVI 在批次去除和生物學(xué)差異保護(hù)之間表現(xiàn)出最佳的平衡性产舞。用于批次校正的數(shù)據(jù)整合工具也可用于整合多組學(xué)單細(xì)胞數(shù)據(jù)（例如，整合從同一組織來(lái)源產(chǎn)生的 scRNA-seq 和 scATAC-seq 數(shù)據(jù)）菠剩，后續(xù)將進(jìn)一步介紹易猫。
3.5. 數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換
盡管嘗試了各種實(shí)驗(yàn)技術(shù)增加測(cè)序輸出，但據(jù)報(bào)道具壮，從單個(gè)細(xì)胞讀取的 peak 僅占 scATAC-seq 分析中總可檢測(cè) peak 的1?10％准颓。因此，使用數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換代替初始 cell-feature 矩陣進(jìn)行下游分析棺妓，可以補(bǔ)償數(shù)據(jù)稀疏性帶來(lái)的限制攘已。由于 scATAC-seq 文件的二元性（對(duì)于單個(gè)細(xì)胞分別用1和0表示基因組區(qū)域的開放和不開放），topic 建模的經(jīng)典文本挖掘方法可用于數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換怜跑。用 TF-IDF 方法對(duì) cell-feature 矩陣進(jìn)行轉(zhuǎn)換样勃，使細(xì)胞群體中稀有 peak 有更大的權(quán)重，變換后的數(shù)據(jù)矩陣趨于捕獲不同細(xì)胞類型特異 peak。還可以利用 Jaccard 距離衡量?jī)蓚€(gè)細(xì)胞間的差異峡眶。更高的測(cè)序深度可以為精確獲取特征值提供幫助剧防，有一些方法通過(guò)測(cè)序深度權(quán)衡每個(gè)細(xì)胞的特征。
3.6. 降維辫樱、聚類及可視化
經(jīng)數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換后 cell-feature 矩陣進(jìn)行降維處理可以減少冗余信息诵姜、高維數(shù)據(jù)的潛在噪聲、下游分析的計(jì)算時(shí)間搏熄。PCA 是一種廣泛使用的線性降維技術(shù)，根據(jù) scree 圖分析或 Jackstraw 檢驗(yàn)確定主成分?jǐn)?shù)目暇赤。Topic 建模方法（例如cisTopic）基于潛在 LDA 生成的主題細(xì)胞分布來(lái)選擇 Topic心例，從而減少矩陣的維數(shù)。雖然 LDA 較耗時(shí)鞋囊，但它可以獲得細(xì)胞類型特異的特征值以提高聚類的準(zhǔn)確性止后。LSI 是通過(guò)使用 TF-IDF 后進(jìn)行 SVD 進(jìn)行降維。MDS 基于細(xì)胞之間的相似性來(lái)降維溜腐。Diffusion map 是降維處理的一種非線性方法译株，它傾向于對(duì)噪聲進(jìn)行排序。雖然一些數(shù)據(jù)分析流程省略了線性降維步驟挺益，但其使用可改善下游分析的總聚類結(jié)果歉糜。這些降維方法的結(jié)果將用作可視化和聚類的輸入。常使用非線性降維技術(shù)望众，例如 t-SNE 和 UMAP 可視化二維或三維空間中的數(shù)據(jù)匪补，這些技術(shù)通常稱為嵌入。UMAP 可視化傾向于更好地保留全局結(jié)構(gòu)烂翰，而 t-SNE 可視化則傾向于保留局部鄰域夯缺。單細(xì)胞分析中，目前關(guān)于用哪種降維方法仍存在爭(zhēng)議甘耿，方法的選擇通常取決于每個(gè)數(shù)據(jù)集的屬性和所使用的數(shù)據(jù)預(yù)處理方法踊兜。因此，建議對(duì)給定的數(shù)據(jù)集應(yīng)用多種可視化方法佳恬，再根據(jù)獲得的結(jié)果進(jìn)行選擇捏境。具有相似開放區(qū)的細(xì)胞可聚集成細(xì)胞群，scATAC-seq 數(shù)據(jù)分析常使用聚類方法：層次聚類毁葱，k-means典蝌，k-medoids 和 Louvain 算法。層次聚類對(duì)于理解細(xì)胞類群之間的整體關(guān)系很有用头谜，結(jié)果常用樹狀圖可視化顯示捕獲的層次關(guān)系骏掀。k-means 和 k-medoid 是需要預(yù)設(shè)聚類數(shù)目的算法，K-medoids 聚類對(duì)噪聲的魯棒性更強(qiáng)，但該方法也需更強(qiáng)的計(jì)算能力截驮。Louvain 聚類是一種基于圖的聚類方法笑陈，常以 KNN 方法的結(jié)果作為輸入。一些分析工具可能具有首選的聚類方法葵袭，但大多數(shù)情況下涵妥，這些方法是可以互換的。最近對(duì) scATAC-seq 數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類測(cè)試結(jié)果顯示坡锡，用 Louvain 聚類的結(jié)果最為令人滿意蓬网。
4 . 產(chǎn)生假設(shè)的下游分析
單細(xì)胞組學(xué)研究的主要目的是針對(duì)復(fù)雜混合的異質(zhì)細(xì)胞群體的不同子集產(chǎn)生生物學(xué)假設(shè)。因此鹉勒，下游分析從識(shí)別細(xì)胞群身份開始帆锋。通常對(duì)每個(gè)細(xì)胞群進(jìn)行 peak calling 以識(shí)別不同細(xì)胞群的可及性染色質(zhì)區(qū)域，然后對(duì)其進(jìn)行統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)禽额，與各種預(yù)先定義的基因組特征（例如順式和反式調(diào)控元件以及遺傳變異）相關(guān)聯(lián)锯厢， 例如與疾病相關(guān)的SNP。下游分析的主要目的是發(fā)現(xiàn)新的調(diào)控元件脯倒，并以細(xì)胞類型特異性的方式了解其功能作用实辑。此外，還可以在下游分析過(guò)程中研究細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中染色質(zhì)可及性的動(dòng)力學(xué)藻丢。
4.1. 細(xì)胞身份注釋
對(duì)于單細(xì)胞組學(xué)數(shù)據(jù)的分析剪撬，細(xì)胞群身份注釋是初步的，但必須謹(jǐn)慎進(jìn)行悠反。錯(cuò)誤的細(xì)胞身份信息可能會(huì)在 scATAC-seq 數(shù)據(jù)的下游分析期間導(dǎo)致錯(cuò)誤的生物學(xué)假設(shè)婿奔。盡管有許多工具可以對(duì) scRNA-seq 數(shù)據(jù)自動(dòng)進(jìn)行細(xì)胞類型注釋，還可以從各種數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得細(xì)胞類型特異性基因列表问慎，但對(duì)于 scATAC-seq 數(shù)據(jù)僅有有限的工具和特定細(xì)胞類型染色質(zhì)可及性的參考數(shù)據(jù)集萍摊。因此，對(duì)于 scATAC-seq 數(shù)據(jù)如叼，必須結(jié)合使用補(bǔ)充方法進(jìn)行細(xì)胞群注釋冰木。目前有兩種方法進(jìn)行細(xì)胞身份注釋：第一個(gè)基于 ATAC peak 的特征注釋，第二個(gè)是利用與參考 scRNA-seq 數(shù)據(jù)的整合進(jìn)行注釋笼恰。細(xì)胞聚類后踊沸，每個(gè)細(xì)胞群的差異可及性區(qū)域可能包含不同的調(diào)控元件。細(xì)胞身份注釋的第一種方法使用細(xì)胞群特異性的 peak 進(jìn)行注釋社证，監(jiān)督或手動(dòng)注釋細(xì)胞群身份需要參考數(shù)據(jù)庫(kù)或有關(guān)細(xì)胞類型特定基因組特征（例如TF motif逼龟，增強(qiáng)子，啟動(dòng)子和TSS）的文獻(xiàn)追葡∠俾桑基于細(xì)胞類型特異的基因列表奕短，啟動(dòng)子和 TSS 被最廣泛地用于細(xì)胞群注釋。一些簡(jiǎn)易的方法通過(guò)啟動(dòng)子或 TSS 上游一定距離內(nèi) peak 的存在來(lái)定義細(xì)胞類型特異性基因的可及性匀钧，而高級(jí)的分析則考慮了遠(yuǎn)端和近端調(diào)控因子的影響翎碑。“基因活性分?jǐn)?shù)”對(duì)與基因啟動(dòng)子區(qū)共開放元件給予不同權(quán)重之斯，從而可以更準(zhǔn)確地利用染色質(zhì)可及性推斷基因表達(dá)水平日杈。與簡(jiǎn)單的使用啟動(dòng)子區(qū)可及性相比，基因活性分?jǐn)?shù)能更好的表征基因表達(dá)佑刷。Garnett 軟件利用基因活性分?jǐn)?shù)和已知細(xì)胞類型的先驗(yàn)特征及標(biāo)記基因?qū)?xì)胞類型進(jìn)行監(jiān)督分類莉擒。第二種方法的優(yōu)勢(shì)是使用了 scRNA-seq 數(shù)據(jù)去區(qū)分細(xì)胞類型√毙酰可將來(lái)自 scRNA-seq 數(shù)據(jù)的基因表達(dá)矩陣與來(lái)自相同細(xì)胞類型的 scATAC-seq 數(shù)據(jù)的基因活性矩陣整合在一起涨冀。將它們投影到最大相關(guān)維度后，使用 MNN 算法將細(xì)胞標(biāo)記從 scRNA-seq 數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)移到 scATAC-seq 數(shù)據(jù)檀何。盡管具有高度主導(dǎo)的細(xì)胞類型或與其他組學(xué)數(shù)據(jù)不匹配的細(xì)胞類型的樣本顯示出準(zhǔn)確性方面的局限性，但細(xì)胞身份注釋的總體結(jié)果與匹配的數(shù)據(jù)集一致廷支。通過(guò)對(duì) scATAC-seq 數(shù)據(jù)中的細(xì)胞群體進(jìn)行半監(jiān)督識(shí)別频鉴，現(xiàn)有的參考 scRNA-seq 和 bulk ATAC-seq 數(shù)據(jù)可用于生成 scATAC-seq 樣本的網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)而將標(biāo)簽進(jìn)行轉(zhuǎn)移恋拍。
4.2. 染色質(zhì)可及性動(dòng)力學(xué)研究
通過(guò)差異可及性區(qū)域分析垛孔、擬時(shí)序相關(guān)的變化、共可及性相關(guān)的各種基因組元件可以產(chǎn)生細(xì)胞發(fā)育調(diào)控的假設(shè)施敢。差異可及性區(qū)域分析用于識(shí)別每種細(xì)胞類型特異的調(diào)控元件周荐，通過(guò)將特定細(xì)胞群的染色質(zhì)可及性與數(shù)據(jù)集中的所有其他細(xì)胞進(jìn)行比較，來(lái)識(shí)別細(xì)胞類型特異的差異可及性區(qū)域僵娃，采用的統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)包括二項(xiàng)式檢驗(yàn)概作、負(fù)二項(xiàng)式廣義線性模型、Wald 檢驗(yàn)默怨、Fisher 精確檢驗(yàn)讯榕、不等方差 t 檢驗(yàn)。用 Benjamini-Hochberg 或Bonferroni 進(jìn)行信息獲取的1％或5％ FDR 調(diào)整匙睹。單細(xì)胞軌跡分析利用細(xì)胞的擬時(shí)序來(lái)重建分化過(guò)程或細(xì)胞譜系愚屁。如果染色質(zhì)可及性在細(xì)胞群內(nèi)是連續(xù)變化的，軌跡分析將非常有用痕檬。Cicero 是 scATAC-seq 常用的軌跡分析軟件霎槐，是 Monocle2 的擴(kuò)展軟件。Cicero 通過(guò)匯總鄰近的 peak 克服數(shù)據(jù)稀疏性梦谜，選擇差異可及性區(qū)域定義時(shí)間狀態(tài)丘跌，利用 DDRTree 方法根據(jù)擬時(shí)序?qū)?xì)胞進(jìn)行排序袭景，可以描述選定基因組區(qū)域的染色質(zhì)可及性動(dòng)力學(xué)。STREAM 是可以處理轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和表觀基因組數(shù)據(jù)的軌跡分析工具碍岔，利用 scATAC-seq 數(shù)據(jù)中高變?nèi)旧|(zhì)可及性區(qū)域內(nèi) k-mer 得分矩陣構(gòu)建擬時(shí)序軌跡浴讯。STREAM 的優(yōu)勢(shì)在于從未處理的原始數(shù)據(jù)文件開始的無(wú)偏見 end-to-end 流程。軌跡分析可用于鑒定與細(xì)胞從一種細(xì)胞類型發(fā)展到另一種細(xì)胞類型相關(guān)的細(xì)胞類型特異調(diào)控元件蔼啦。例如榆纽，如果在分化過(guò)程中 TF motif 的可及性發(fā)生了顯著變化，則可進(jìn)一步分析其參與分化的激活或啟動(dòng)捏肢。不同基因組元件之間的相互作用對(duì)于理解調(diào)控網(wǎng)絡(luò)非常重要奈籽，可通過(guò)不同基因組元件的共可及性分析互作關(guān)系。Cicero 對(duì)相似的細(xì)胞進(jìn)行分組生成細(xì)胞可及性矩陣鸵赫，計(jì)算重疊的基因組窗口中每對(duì)基因組元件之間的協(xié)方差得到共可及性關(guān)系衣屏，用于分析 TSS 與增強(qiáng)子，啟動(dòng)子和其他基因組元件之間的相互作用辩棒。
4.3. 基于 TF motif 的假設(shè)產(chǎn)生
TF 主要是基因表達(dá)的反式作用調(diào)控子狼忱。scATAC-seq 的分析可以識(shí)別異質(zhì)性細(xì)胞群體中細(xì)胞類型特異的 TF，TF 高度參與了發(fā)育過(guò)程一睁，因此對(duì)細(xì)胞間 TF 表達(dá)的變異進(jìn)行分析將有助于了解它們?cè)诩?xì)胞分化過(guò)程中的作用钻弄。此外，scATAC-seq 可同時(shí)分析與相關(guān) TF 活性相關(guān)的順式調(diào)控元件者吁。用 scATAC-seq 數(shù)據(jù)研究 TF 需軟件包窘俺、數(shù)據(jù)庫(kù)及TF 結(jié)合 motif。最初复凳，主要是用已知的 TF motifs 進(jìn)行 scATAC-seq 的分析瘤泪。一些不是專為 scATAC-seq 開發(fā)的生物信息學(xué)工具，例如 Homer 和 FIMO育八，也可用于識(shí)別開放染色質(zhì)區(qū)域內(nèi)的 TF motif对途。chromVAR 是專為scATAC-seq 分析開發(fā)的軟件包，用于計(jì)算 TF motif 和 k-mers 的校正偏差和 z-score髓棋。利用 ChromVAR 計(jì)算已得到免疫細(xì)胞掀宋、心臟祖細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞等細(xì)胞類型相關(guān)的 TF仲锄。此外劲妙，可以將 TF motif 可及性與 scRNA-seq 數(shù)據(jù)的 TF 表達(dá)水平進(jìn)行比較，使用如卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)和隨機(jī)森林分類等模型儒喊，識(shí)別細(xì)胞類型特異的 TF 并根據(jù)這些 TF 預(yù)測(cè)細(xì)胞類型镣奋。
4.4. 基于基因的假設(shè)產(chǎn)生
scRNA-seq 用于異質(zhì)性細(xì)胞群體的基因表達(dá)譜研究，而對(duì)于 scATAC-seq怀愧，基因表達(dá)可以通過(guò) TSS侨颈、基因區(qū)域和其他調(diào)控元件的染色質(zhì)可及性信息推斷余赢。活性基因的 TSS 和 TTS 位于染色質(zhì)開放區(qū)或核小體耗竭區(qū)內(nèi)哈垢，因此妻柒，TSS的可及性可用于scATAC-seq 數(shù)據(jù)基于基因的下游分析。UROPA 使用基因組注釋數(shù)據(jù)庫(kù)去注釋 scATAC-seq peak 內(nèi)的TSS耘分，再用于比較 TSS 染色質(zhì)的開放和閉合举塔、計(jì)算 TSS 基因集偏差、根據(jù)已知的標(biāo)記基因鑒定細(xì)胞類型和狀態(tài)等下游分析求泰。然而央渣，僅考慮 TSS 的染色質(zhì)狀態(tài)可能無(wú)法完全表征基因表達(dá)，而計(jì)算“基因活性評(píng)分”還考慮到調(diào)控元件的影響渴频，可以改善可及性信息向基因表達(dá)的轉(zhuǎn)化芽丹。Cicero 基因活性評(píng)分考慮了基因TSS 近端和遠(yuǎn)端的可及性，并基于共可及性給予不同權(quán)重卜朗“蔚冢基因活性評(píng)分已用于比較同一 scATAC-seq 數(shù)據(jù)的 TF motif 可及性和 TF 基因活性分?jǐn)?shù)、根據(jù)細(xì)胞類型特異性標(biāo)記基因注釋細(xì)胞场钉、將 scRNA-seq 數(shù)據(jù)集的細(xì)胞標(biāo)簽轉(zhuǎn)移至匹配的 scATAC-seq 數(shù)據(jù)集蚊俺。最后，Deeptools 和 MACS2 生成的 bigwig 文件惹悄，可以使用基因組瀏覽器（例如Gviz春叫、IGV 和 UCSC）展示基因區(qū)域內(nèi)染色質(zhì)可及性肩钠。不同細(xì)胞群間基因集合的富集分析可用于識(shí)別與細(xì)胞身份相關(guān)的通路泣港，GO 和KEGG 是最常用的數(shù)據(jù)庫(kù)〖劢常基于細(xì)胞類型特異性可及性區(qū)域相關(guān)的基因分析與細(xì)胞群相關(guān)的通路分析当纱，使用基因區(qū)域上游和下游延伸區(qū)域內(nèi)的peak、TSS 區(qū)域內(nèi)的 peak 或具有基因活性評(píng)分的peak 作為通路分析的輸入數(shù)據(jù)踩窖。GREAT坡氯、clusterProfiler 等基因集富集工具都可用于 scATAC-seq 數(shù)據(jù)。
4.5. 基于增強(qiáng)子的假設(shè)產(chǎn)生
增強(qiáng)子是遠(yuǎn)離其調(diào)控靶基因的順式調(diào)控元件洋腮。通過(guò)分析染色質(zhì)的3D 結(jié)構(gòu)箫柳，已鑒定出增強(qiáng)子與其他調(diào)節(jié)元件的近端或遠(yuǎn)端相互作用。增強(qiáng)子密集區(qū)被稱為超級(jí)增強(qiáng)子啥供，是細(xì)胞類型和狀態(tài)特異的悯恍，并參與與疾病相關(guān)的調(diào)控節(jié)點(diǎn)』锖基于單細(xì)胞分辨率研究增強(qiáng)子可預(yù)測(cè)特定細(xì)胞類型涮毫，且比其他順式調(diào)控元件和轉(zhuǎn)錄組具有更高的準(zhǔn)確性瞬欧。許多研究集中于鑒定細(xì)胞類型特異性增強(qiáng)子及其在發(fā)育過(guò)程中的作用。增強(qiáng)子分析的最常見類型包括識(shí)別特定細(xì)胞類型的遠(yuǎn)端和近端增強(qiáng)子和增強(qiáng)子活性的相對(duì)富集罢防。VISTA艘虎、CAD、Redfly Enhancer 和 Vienna Tiles等數(shù)據(jù)庫(kù)都可以用于這種分析咒吐。此外野建，在一些數(shù)據(jù)分析流程中還建議分析增強(qiáng)子與啟動(dòng)子或具有共可及性的基因的相互作用、配對(duì)的 scRNA-seq 數(shù)據(jù)渤滞、虛擬潛在空間贬墩、Activity-by-Contact模型。
4.6. 與疾病相關(guān)的遺傳變異的假設(shè)產(chǎn)生
通過(guò) GWAS 和 eQTL 分析檢測(cè)到的與疾病相關(guān)的SNP妄呕，是了解疾病的基因組調(diào)控的有效方式陶舞。由于大多數(shù) SNP 位于非編碼區(qū)，可以預(yù)期許多 GWAS SNP 和 eQTL與順式調(diào)控元件有關(guān)绪励。因此肿孵，開放染色質(zhì)區(qū)域的研究可用于確定這些變異位點(diǎn)的功能效應(yīng)。此外疏魏，鑒定與疾病相關(guān)變異有關(guān)的細(xì)胞類型停做，對(duì)于深入了解這些變異至關(guān)重要。scATAC-seq 從單細(xì)胞水平鑒定 DNA 序列和調(diào)節(jié)元件的染色質(zhì)可及性大莫，將遺傳變異與其細(xì)胞和功能靶標(biāo)聯(lián)系起來(lái)蛉腌。盡管通過(guò)批量測(cè)序方法將表觀遺傳學(xué)特征與 GWAS 信號(hào)關(guān)聯(lián)已經(jīng)提供了有用結(jié)果，但單細(xì)胞分辨率分析使我們能夠克服細(xì)胞類型異質(zhì)性帶來(lái)的局限性只厘。實(shí)際上烙丛，一些研究已經(jīng)證明了在細(xì)胞類型特異性 peak 中提供 GWAS SNP 富集譜的重要性。gchromVAR 為改良版的 chromVAR羔味，對(duì)每個(gè)單細(xì)胞進(jìn)行 GWAS 富集評(píng)分河咽，以特定于細(xì)胞類型的方式鑒定基因組區(qū)域中的因果變異以及這些變異的推定靶基因。利用共可及性測(cè)定可以分析與 GWAS SNP 和 GTEx eQTL 重疊的互聯(lián) peak 與其他包含調(diào)控因子的 peak赋元。GREGOR 還用于注釋來(lái)自不同數(shù)據(jù)庫(kù)的疾病相關(guān) SNP 的富集忘蟹。最近的一些研究還用深度學(xué)習(xí)和機(jī)器學(xué)習(xí)框架等更復(fù)雜模型來(lái)識(shí)別細(xì)胞類型特異的功能 SNP 和相關(guān)新功能基因。
5與單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的整合分析
將單細(xì)胞基因表達(dá)和染色質(zhì)可及性數(shù)據(jù)整合可以改善細(xì)胞身份注釋搁凸。更重要的是媚值，多模式數(shù)據(jù)的聯(lián)合分析將有助于檢測(cè)感興趣細(xì)胞狀態(tài)下反式和順式調(diào)控元件之間的相關(guān)性』ぬ牵可以通過(guò)實(shí)驗(yàn)方法和計(jì)算方法對(duì)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組和染色質(zhì)可及性進(jìn)行整合分析褥芒。
圖3. 通過(guò)實(shí)驗(yàn)方法和計(jì)算方法將 scATAC-seq 數(shù)據(jù)與scRNA-seq 數(shù)據(jù)整合在一起。相同細(xì)胞類型的基因表達(dá)和染色質(zhì)可及性的整合分析可用于確認(rèn)細(xì)胞身份注釋并促進(jìn)生成基于調(diào)控元件的新假設(shè)椅文。例如喂很，鑒定 peak 與基因之間的相互作用可以推斷出增強(qiáng)子與啟動(dòng)子之間的相互作用惜颇。比較基因的表達(dá)與擬時(shí)序中 TF 富集區(qū)域的可及性，可以揭示轉(zhuǎn)錄與調(diào)控區(qū)域之間的動(dòng)力學(xué)關(guān)系少辣。比較基因表達(dá)與跨細(xì)胞類型或樣品組的 TF 富集區(qū)域的可及性凌摄，可以揭示細(xì)胞類型或亞群特異的表達(dá)基因和基因組可及性區(qū)域。
整合分析的實(shí)驗(yàn)方法側(cè)重于同時(shí)從同一細(xì)胞獲得轉(zhuǎn)錄組和表觀基因組數(shù)據(jù)漓帅。多模式單細(xì)胞分析方法 sci-CAR 對(duì) scRNA-seq和 scATAC-seq 都采用了組合索引方法提高通量锨亏。另一種方法是 scCAT-seq，將細(xì)胞質(zhì)組分和細(xì)胞核分離忙干，分別進(jìn)行 scRNA-seq 和 scATAC-seq器予。SNARE-seq 利用鏈接 barcode 在單個(gè)液滴中捕獲轉(zhuǎn)座的 DNA 片段中的 gDNA 和細(xì)胞核中的 mRNA，從而對(duì)使用相同 barcode 的細(xì)胞進(jìn)行平行測(cè)序捐迫。該方法用化學(xué)試劑固定細(xì)胞乾翔，然后對(duì)單個(gè)細(xì)胞分選進(jìn)行批量轉(zhuǎn)座，以降低成本并簡(jiǎn)化總體程序施戴。使用多種模式的單細(xì)胞技術(shù)反浓，可以將染色質(zhì)的可及性直接與基因表達(dá)進(jìn)行比較，以了解順式/反式調(diào)控元件與相關(guān)基因表達(dá)之間的功能關(guān)系赞哗。目前有算法能夠進(jìn)行來(lái)源于不同樣本組雷则、不同實(shí)驗(yàn)甚至是不同技術(shù)的單細(xì)胞基因組數(shù)據(jù)的整合分析》舅瘢基于 NMF 的方法月劈，如 CoupledNMF 和 LIGER，已被用于多模式的單細(xì)胞數(shù)據(jù)整合分析藤乙。Seurat v3 是 scRNA-seq 和 scATAC-seq 整合分析的常用軟件猜揪。Seurat v3通過(guò)將兩個(gè)不同的數(shù)據(jù)集投影到由相關(guān)變量定義的子空間中，然后識(shí)別數(shù)據(jù)集之間的錨點(diǎn)湾盒，從而整合多模式單細(xì)胞數(shù)據(jù)湿右。Harmony 是一種基于數(shù)據(jù)特異細(xì)胞群迭代校正的快速且可擴(kuò)展的算法诅妹。最近報(bào)道了很多數(shù)據(jù)整合的算法罚勾，包括 MMD-MA 和 DC3。單細(xì)胞多組學(xué)整合已用于驗(yàn)證細(xì)胞身份吭狡，將差異表達(dá)基因與差異科技型區(qū)域連接起來(lái)推斷增強(qiáng)子-啟動(dòng)子的相互作用尖殃。觀察到 TF-motif 預(yù)測(cè)的增強(qiáng)子可及性在基因表達(dá)變化之前的趨勢(shì)，并鑒定了跨細(xì)胞類型或樣品組的染色質(zhì)可及性和轉(zhuǎn)錄的保守性划煮。
6 結(jié)論與展望
單細(xì)胞測(cè)序的高成本和數(shù)據(jù)的高復(fù)雜性可能會(huì)限制許多研究人員對(duì)單細(xì)胞生物學(xué)的可及性探究送丰。科研人員付出了許多努力來(lái)改善包括 scATAC-seq 數(shù)據(jù)分析在內(nèi)的單細(xì)胞組學(xué)的實(shí)驗(yàn)和計(jì)算方法弛秋。盡管尚未在數(shù)據(jù)分析流程中達(dá)成合理的共識(shí)器躏，但近來(lái)有關(guān) scATAC-seq 的數(shù)據(jù)生成技術(shù)和數(shù)據(jù)分析方法的文章數(shù)量呈指數(shù)型增長(zhǎng)俐载。 使用不同方法進(jìn)行數(shù)據(jù)生成和分析的基準(zhǔn)研究將為建立 scATAC-seq 數(shù)據(jù)分析的最佳流程提供有用的信息。而且登失，與其他類型的單細(xì)胞和大量組學(xué)數(shù)據(jù)以及基因組變異數(shù)據(jù)的整合遏佣，將大大增強(qiáng) scATAC-seq 在疾病相關(guān)復(fù)雜基因調(diào)控關(guān)系中的應(yīng)用研究。特別是將 scATAC-seq 與其他表觀技術(shù)（例如 ChIP-seq 和 Hi-C）整合在一起揽浙，將揭示3D染色質(zhì)結(jié)構(gòu)状婶。這種綜合的多模式分析將有助于識(shí)別與疾病進(jìn)展有關(guān)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，這些調(diào)節(jié)因子通常是潛在的治療靶標(biāo)和診斷的生物標(biāo)志物馅巷。未來(lái)膛虫，scATAC-seq 將促進(jìn)表觀遺傳調(diào)控的整體發(fā)展，并參人類和其他多細(xì)胞生物的正常細(xì)胞發(fā)育和疾病研究钓猬。
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