單細(xì)胞技術(shù)在 2013 年和 2019 年被 Nature Methods 評(píng)選為年度技術(shù)揖庄，2018 年被 Science 評(píng)選為 10 大科學(xué)突破。據(jù)統(tǒng)計(jì)欠雌，CNS 發(fā)表單細(xì)胞領(lǐng)域文章已經(jīng)超過(guò) 900 篇蹄梢，其中 2019~2020 期間發(fā)表 285 篇。國(guó)自然資助的單細(xì)胞項(xiàng)目已經(jīng)達(dá)到 513 項(xiàng)富俄，總額 4.1 億禁炒，其中 2019 年中標(biāo) 113 項(xiàng)，總額 6,606 萬(wàn)霍比。
如果說(shuō)單細(xì)胞技術(shù)是熱門幕袱，那空間轉(zhuǎn)錄組就是黑馬，10x Visium 技術(shù)一經(jīng)問(wèn)世悠瞬，便備受矚目们豌。空間轉(zhuǎn)錄組避免了組織中細(xì)胞位置信息丟失的現(xiàn)象阁危，可以觀測(cè)到組織中不同區(qū)域細(xì)胞構(gòu)成和原始基因表達(dá)玛痊，直接獲取不同功能區(qū)域的差異基因表達(dá)信息。
如果說(shuō) 09~19 年是單細(xì)胞技術(shù)黃金十年的話狂打，那么接下來(lái) 5 年一定是空間轉(zhuǎn)錄組的天下擂煞。
單細(xì)胞技術(shù)和空間轉(zhuǎn)錄組二者的結(jié)合，可以碰撞出不一樣的火花趴乡，既能挖掘出大量前人沒(méi)有發(fā)現(xiàn)的信息对省，也能大幅度提升文章的檔次。
雖然兩者都是現(xiàn)階段的科研寵兒晾捏，但是將二者羅列在一起蒿涎，就一定可以發(fā)表高分文章嗎？
答案是：
NO惦辛！
沒(méi)有合理的課題設(shè)計(jì)劳秋，
幾十萬(wàn)的科研經(jīng)費(fèi)只能是打水漂！
那如何進(jìn)行課題設(shè)計(jì)呢胖齐？來(lái)來(lái)來(lái)玻淑，歐易生物傾囊相授：
構(gòu)建精細(xì)化圖譜，為課題奠定良好的基礎(chǔ)
構(gòu)建細(xì)胞圖譜呀伙，是單細(xì)胞研究的一大利器补履。設(shè)計(jì)單細(xì)胞課題時(shí)，可以先從細(xì)胞圖譜出發(fā)剿另。
構(gòu)建單細(xì)胞圖譜箫锤，需要注意贬蛙，人和小鼠的全組織圖譜已經(jīng)發(fā)表，所以一定要注意圖譜的精細(xì)化和差異化谚攒。
什么是精細(xì)化阳准？
別人發(fā)表了肝臟細(xì)胞圖譜，那我們可以構(gòu)建肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞圖譜五鲫。
什么是差異化溺职？
別人發(fā)表了肝癌細(xì)胞圖譜，那我們可以構(gòu)建肝炎的細(xì)胞圖譜位喂。
生物體構(gòu)成的復(fù)雜性浪耘，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出人們的認(rèn)知。單細(xì)胞技術(shù)是解析這種復(fù)雜性的一把利器塑崖，細(xì)胞圖譜構(gòu)建的精細(xì)化程度越高七冲、差異化程度越大，發(fā)現(xiàn)未知的重大現(xiàn)象的可能性越大规婆。
在現(xiàn)階段澜躺，細(xì)胞圖譜的精細(xì)化和差異化閾值沒(méi)有上限。只要你能設(shè)計(jì)出來(lái)并且可以實(shí)施抒蚜，那就放心大膽的去做掘鄙。
單細(xì)胞圖譜挖掘，大有可為
獲得細(xì)胞圖譜后嗡髓，根據(jù) marker 基因操漠，針對(duì)感興趣的細(xì)胞類型，進(jìn)行多次亞型劃分饿这，可以判定出前人沒(méi)有發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞亞型浊伙。還是上面那句話，生物體構(gòu)成之復(fù)雜长捧，是你我所無(wú)法想象的嚣鄙。只要細(xì)胞數(shù)足夠大，一定可以找出教科書上沒(méi)有提及的細(xì)胞種類串结。
就算捕獲到的細(xì)胞數(shù)目不足以支撐發(fā)現(xiàn)稀有細(xì)胞哑子，不同樣本類型（sample type）、細(xì)胞類型（cell type）或細(xì)胞群體（cell cluster）之間的比較肌割，也能提供大量的數(shù)據(jù)供我們深入挖掘卧蜓。
例如針對(duì)感興趣的細(xì)胞群體進(jìn)行擬時(shí)序分析挖掘不同細(xì)胞群體的分化發(fā)育軌跡，GESA 分析挖掘不同細(xì)胞群體的功能和通路声功，或細(xì)胞互作分析不同細(xì)胞群體之間的聯(lián)系，都是常用的分析思路宠叼。
基于上述發(fā)現(xiàn)之后先巴，再針對(duì)關(guān)鍵性 marker 基因做一個(gè) FISH 驗(yàn)證其爵，以 NC 為代表的 10 分文章基本就能拿下。
空間轉(zhuǎn)錄組聯(lián)合伸蚯，恰到好處
上面的思路摩渺，是單細(xì)胞最為常見(jiàn)的分析套路。做到這一步剂邮，根據(jù)單細(xì)胞層面的數(shù)據(jù)摇幻，大家對(duì)于所研究的細(xì)胞群體會(huì)有初步的認(rèn)識(shí)。繼續(xù)朝下深入的話挥萌，一般有兩個(gè)思路绰姻，功能驗(yàn)證和組學(xué)聯(lián)合。
功能驗(yàn)證的思路引瀑，以后有機(jī)會(huì)可以再深入聊聊狂芋。組學(xué)聯(lián)合的種類有很多，蛋白層面憨栽、表觀層面和免疫層面等等帜矾。今天我們主要討論空間層面的組學(xué)聯(lián)合。
首先大家需要清楚屑柔，為什么要做空間轉(zhuǎn)錄組屡萤？
做完上面提到的單細(xì)胞內(nèi)容后，大家對(duì)于目標(biāo)細(xì)胞群體應(yīng)該有了初步的認(rèn)識(shí)掸宛，但是仍然會(huì)有很多問(wèn)題值得商榷死陆，例如：
細(xì)胞類型鑒定完之后，可能會(huì)發(fā)現(xiàn)對(duì)照組和處理組的細(xì)胞類型差不多旁涤，但是表型卻大同小異翔曲。同樣類型的細(xì)胞，為什么在不同樣本中的表現(xiàn)差異如此之大劈愚？基因表達(dá)不同的緣故嗎瞳遍？那又是什么因素導(dǎo)致相同類型的細(xì)胞基因表達(dá)差異如此之大？
通過(guò)降維聚類菌羽，特征相似的細(xì)胞聚集在一起掠械。基因表達(dá)相似注祖，便代表這一群細(xì)胞行駛的功能是一樣的嗎猾蒂？既然特征相似，為什么細(xì)胞和細(xì)胞之間是晨，在二維平面上的分布還是有一定距離肚菠？聚類之后的細(xì)胞分布，和細(xì)胞在組織上的真實(shí)分布有什么關(guān)系罩缴？
細(xì)胞的異質(zhì)性是真實(shí)存在的蚊逢，而在單細(xì)胞水平下是研究是以群（cluster）為最小單元层扶，這樣分析是否合理？以群為單位烙荷，是否會(huì)掩蓋或忽略掉細(xì)胞之間的關(guān)鍵信息镜会？
單細(xì)胞水平下分析得到的細(xì)胞分化發(fā)育軌跡，或細(xì)胞和細(xì)胞之間的通訊聯(lián)系终抽，在空間上是否真實(shí)分布在臨近區(qū)域戳表？不同細(xì)胞之間的聯(lián)系，是直接昼伴，還是間接匾旭？或者反過(guò)來(lái)，單細(xì)胞水平下分析得到的功能相似的細(xì)胞群體亩码，在組織中的分布季率，一定是在同一區(qū)域嗎？
這些問(wèn)題描沟，如果僅僅靠單細(xì)胞一個(gè)層面的數(shù)據(jù)飒泻，是很難解釋清的。所以需要在單細(xì)胞的基礎(chǔ)上吏廉，聯(lián)合空間轉(zhuǎn)錄組泞遗，二者相互印證，才能獲取更真實(shí)的信息席覆。
接下來(lái)討論一下史辙，如何進(jìn)行單細(xì)胞聯(lián)合空間轉(zhuǎn)錄組的樣本設(shè)計(jì)？
目前空間轉(zhuǎn)錄組價(jià)格還是比較貴的佩伤，一張 slides 要十幾二十萬(wàn)聊倔。但是一張 slide 有 4 個(gè)捕獲區(qū)域，就是可以處理 4 個(gè)冷凍切片生巡，這里可以做的文章就大了耙蔑。
之前單細(xì)胞的設(shè)計(jì)，我們選取了 Control:Case = 3:3 的模式孤荣。
如果所研究的病理組織信息可以集中體現(xiàn)在一張切片上甸陌，那么一張空間 slides 上放置 Control1+Case3，或者 Control2+Case2 都是可以的盐股。
前者處理組的切片數(shù)為 3钱豁，目的是為了更好的分析處理之后不同樣本之間的異質(zhì)性。后者是一種比較穩(wěn)妥的方案疯汁，對(duì)照組和處理組都設(shè)置了重復(fù)牲尺，可以規(guī)避掉切片質(zhì)量不均導(dǎo)致空間結(jié)果不好的風(fēng)險(xiǎn)。
如果需要多張切片才能完整描述所研究的病理組織信息幌蚊，那就得設(shè)置多張空間 slides谤碳，甚至需要一張 slides 來(lái)描述同一個(gè)組織的不同病理區(qū)域凛澎。
這個(gè)時(shí)候，基于經(jīng)費(fèi)的考慮估蹄，可以先選擇一個(gè)處理組的樣本做空間轉(zhuǎn)錄組，拿到有意思的結(jié)果之后沫换，可以慢慢補(bǔ)充其他處理組樣本的空間結(jié)果臭蚁。
至于對(duì)照組的空間結(jié)果是否需要補(bǔ)充，這個(gè)后面會(huì)提及讯赏。
關(guān)于單細(xì)胞聯(lián)合空間轉(zhuǎn)錄組的樣本設(shè)計(jì)垮兑，還有一個(gè)很重要的點(diǎn)，是否需要對(duì)同一個(gè)樣本同時(shí)進(jìn)行單細(xì)胞和空間漱挎？這個(gè)問(wèn)題系枪，必須在一開(kāi)始就想清楚，否則會(huì)導(dǎo)致整個(gè)課題的失敗磕谅。
我的建議是私爷，如果條件允許，選擇多個(gè)組學(xué)在同一個(gè)樣本上進(jìn)行膊夹，特別是針對(duì)人的病理或腫瘤樣本衬浑。
所以在樣本準(zhǔn)備時(shí)候，就要將組織一分為二放刨，一半用來(lái)做單細(xì)胞工秩，另外一半凍存起來(lái)為空間轉(zhuǎn)錄組做好備份。
小鼠樣本組織通常都比較小进统，實(shí)施起來(lái)比較麻煩助币，可以選擇一只小鼠做單細(xì)胞，另取一只小鼠做空間螟碎。小鼠模型的背景均一性較好眉菱，這樣操作也可以。但是對(duì)于腫瘤樣本抚芦，建議最好還是在同一個(gè)樣本同時(shí)進(jìn)行單細(xì)胞和空間轉(zhuǎn)錄組倍谜。
最后，討論一下叉抡，如何進(jìn)行單細(xì)胞和空間轉(zhuǎn)錄組的聯(lián)合分析尔崔？
前面說(shuō)過(guò)，通過(guò)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組可以獲取研究對(duì)象的細(xì)胞圖譜褥民，進(jìn)而分析得到目標(biāo)細(xì)胞群的 marker 基因季春、分化軌跡和通訊關(guān)系等結(jié)果。
上面在討論「為什么要做空間轉(zhuǎn)錄組消返？」所提到的幾個(gè)問(wèn)題载弄，都是進(jìn)行單細(xì)胞和空間轉(zhuǎn)錄組聯(lián)合時(shí)可以進(jìn)行的分析內(nèi)容耘拇，此處不再贅述，下面羅列一些新的聯(lián)合分析關(guān)注點(diǎn)宇攻。
一惫叛、通過(guò)單細(xì)胞細(xì)胞類型鑒定結(jié)果輔助判定空間轉(zhuǎn)錄組的細(xì)胞類型
空間轉(zhuǎn)錄組分辨率達(dá)不到單細(xì)胞水平，10x 目前一個(gè) spot 捕獲 1~10 個(gè)細(xì)胞逞刷，所以如果僅僅通過(guò)空間轉(zhuǎn)錄組的數(shù)據(jù)是無(wú)法精確判定每個(gè) spot 的主要細(xì)胞類型的嘉涌。
最近 Nature Biotechnology 上發(fā)表了一個(gè) MIA 算法，可以很好的解決空間數(shù)據(jù)冗雜的現(xiàn)象夸浅。
同時(shí)仑最，結(jié)合空間轉(zhuǎn)錄組提供的組織水平的 HE 染色信息，也可以對(duì)單細(xì)胞鑒定到的細(xì)胞類型進(jìn)行修正帆喇。
二警医、通過(guò)空間轉(zhuǎn)錄組快速定位單細(xì)胞分析獲得 marker 基因
單細(xì)胞數(shù)據(jù)分析可以預(yù)測(cè)到很多 marker 基因，但是并非所有 marker 基因都能被驗(yàn)證出來(lái)坯钦。
一部分原因是由于分析預(yù)測(cè)的 marker 基因具有假陽(yáng)性的可能预皇，一部分原因也是由于驗(yàn)證過(guò)程中沒(méi)有明確的觀測(cè)區(qū)域?qū)е隆?/p>
單細(xì)胞測(cè)序獲得的亞型，往往需要復(fù)雜的免疫熒光驗(yàn)證婉刀，如果有空間轉(zhuǎn)錄組的數(shù)據(jù)深啤，也可以快速整合，定位單細(xì)胞測(cè)序得到的亞群在空間中的位置路星。
三溯街、 對(duì)比不同分組空間結(jié)果，深入挖掘單細(xì)胞數(shù)據(jù)
前面給大家建議的兩種樣本設(shè)計(jì)方案里洋丐，多張切片的方案中提到先做處理樣本的空間轉(zhuǎn)錄組呈昔，畢竟大家更為關(guān)注處理之后組織類型的變化過(guò)程。
如果只做了處理樣本的空間轉(zhuǎn)錄組的話友绝，此時(shí)課題設(shè)計(jì)是以單細(xì)胞為主堤尾，空間為輔，文章中的討論需要注意主次迁客。
如果經(jīng)費(fèi)充足的話郭宝，建議同時(shí)補(bǔ)充對(duì)照組的空間轉(zhuǎn)錄組，對(duì)比不同類型樣本之間空間信息的差異掷漱，可以深入探討一系列的問(wèn)題——
a) 空間結(jié)構(gòu)是否具有明確區(qū)域劃分粘室？
b) 不同區(qū)域之間是否有特異性的 marker？
c) 單細(xì)胞分化發(fā)育軌跡和空間位置是否有關(guān)聯(lián)卜范？
d) 不同區(qū)域的細(xì)胞之間是否存在通訊關(guān)系衔统？
單細(xì)胞和空間轉(zhuǎn)錄組都屬于當(dāng)今最前沿的科研技術(shù)。很多老師都希望在自己課題中運(yùn)用這些前沿技術(shù)，以此可以快速發(fā)表高分文章锦爵。
但是就如上文所言舱殿，技術(shù)雖好，但正確運(yùn)用才是關(guān)鍵险掀。所以大家一定要在最開(kāi)始設(shè)計(jì)好自己的課題思路沪袭，否則到最后只能「一場(chǎng)空」。
